Wenn der Schein trügt

  • Florian Baumgart, Forschungsgruppe Biophysik, © TU WienFlorian Baumgart, Forschungsgruppe Biophysik, © TU Wien

Mit Licht kann man nur Strukturen abbilden, die größer sind als die halbe Wellenlänge des Lichtes. Das erkannte Ernst Abbe bereits um 1870. Allerdings gibt es gewisse Schlupflöcher, deren Nutzung für eine höhere Auflösung das Nobelpreiskomitee bewog, diese Techniken 2014 mit dem renommierten Preis zu ehren.

Wenn man unterschiedliche Moleküle zu unterschiedlichen Zeitpunkten aufleuchten lässt, kann man sie am Ende zu einem scharfen Bild mit höherer Auflösung zusammenfügen. Natürlich ist dieses Bild dann kein reales Bild, sondern das Ergebnis einer komplexen Berechnung aus den Daten vieler Bilder. Hierbei treten wiederum Schwierigkeiten auf, die in den zugrundeliegenden Algorythmen ihren Ursprung haben.

Die neuen Mikroskopietechniken werden unter anderem in der Erforschung von Membranproteinen in Zellen einesetzt. Viele Membranproteine scheinen überwiegend in Clustern auf der Zelloberfläche lokalisiert zu sein. Nun zeigt sich, dass vieles von dem, was man bisher für Proteincluster auf Zelloberflächen hielt, in Wahrheit eine Mehrfachzählung ist. Eine neue Methode, die an der TU Wien entwickelt und in „Nature Methods“ publizierte wurde, kann beides nun unterscheiden.

In der Vergangenheit wurde vielfach untersucht, wie die Proteine auf der Zellmembran angeordnet sind.

Man wusste, dass T-Zellen bei der Antigenerkennung in kurzer Zeit stabile Proteincluster ausbilden können, die so groß sind, dass man sie sogar mit klassischer Fluoreszenzmikroskopie nachweisen kann. Nanoskopisch kleine Proteincluster, so dachte man, müssten Vorläufer dieser größeren Strukturen sein, mit entscheidender Bedeutung für die Funktion von T-Zellen.

Nanoskopie ist aber keine Hobbyfotographie, auslöser drücken und fertig ist das Bild. Es gibt viele Fehlerquellen, man muss die gewonnenen Daten sorgfältig auswerten, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Manche Moleküle können z.B. wiederholt aufleuchten, diese mehrfachen Lichtsignale kann man dann leicht als Molekülcluster fehlinterpretieren.

Forscher an der Universität Wien haben überlegt, wie man Cluster abwechselnd leuchtender Moleküle von einem einzigen, immer wieder blinkenden Molekül unterscheiden kann.

Gelungen ist das, indem die Konzentration der zur Markierung verwendeten Fluorophore schrittweise verändert wurde. In den aufgenommen Bildern können zufällig verteilte Moleküle mehrfach abgebildet werden, oder es kann sich tatsächlich um Clusterbildung handeln. Doch statistisch unterscheidet sich die Verteilung der Molekülpositionen in den beiden Fällen. Versammeln sich die Proteine tatsächlich in Clustern, dann werden dort zwar mehr Molekülpositionen sichtbar aber dazwischen bleiben dunkle Freiräume. Handelt es sich allerdings um einzelne Moleküle, die mehrfach aufleuchten, dann wird bei steigender Konzentration fluoreszierender Moleküle die gesamte Fläche der Probe mit Molekülpositionen aufgefüllt ohne sich lokal massiv zu häufen.

Originalpublikation:
Baumgart et al.: Varying label density allows artifact-free analysis of membrane-protein nanoclusters', Nature Methods, DOI: 10.1038/nmeth.3897

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