Analyse von Biomarkern

  • Dr. Georg Kneer, Varian Deutschland GmbH  Dr. Georg Kneer, Varian Deutschland GmbH
  • Dr. Georg Kneer, Varian Deutschland GmbH
  • Dr. Susanne Sölter, Varian Deutschland GmbH
  • Abb. 1: Varian 320-MS LC/MS/MS Instrumentelle Konfiguration: Varian 320-MS LC/MS/MS Varian 212-LC Binäres LC/MS-Pumpensystem Varian HTS PAL Autosampler
  • Abb. 2: Für die Quantifizierung geeignete Fragmentionen. Von oben nach unten: 221 -> 75, 221 -> 85, 221 -> 159, 221 -> 203, 226 -> 75 (D5-EtG, IS)
  • Abb. 3: Chromatogramme für aufgestockten Urin von 10 ppb bis 10 ppm für den Übergang 221 -> 75 (obere Hälfte) und 221 -> 85 (untere Hälfte)
  • Abb. 4: Kalibrierkurve für EtG (221 -> 85) von 10 ppb bis 10 ppm

Schnelle und empfindliche Analyse von Biomarkern. Bestimmung von EtG in Urin mit LC/MS/MS.

β-D-Ethylglucuronid (EtG) ist ein primärer Metabolit des Ethanols, welcher vom Körper als direkte Folge des Alkoholkonsum gebildet wird. Etwa 0,02 % des konsumierten Alkohols werden in der Leber mit Glucuronsäure zum Ethylglucuronid umgesetzt und über den Urin ausgeschieden.

EtG kann nach dem Alkoholkonsum im Blut bis zu 36 Stunden, im Urin sogar bis zu fünf Tagen nachgewiesen werden. Ein positiver Befund von EtG im Urin gibt einen starken Hinweis auf kürzlichen Alkoholkonsum, selbst wenn der Alkohol selber im Körper nicht mehr nachweisbar ist.

EtG wird deshalb als Biomarker für Alkoholkonsum angesehen und kann Rückfälle einer Person anzeigen, die auf Alkoholentzug ist. Die Analyse von EtG findet zunehmend Akzeptanz in Fällen von Führerscheinentzug, Kriminalverfahren und bei der Kontrolle von Patienten.

Die Varian Pursuit C18 HPLC-Säulen liefern eine gute und schnelle Chromatographie für die Analyse von EtG in Urinproben. Unter Verwendung des Varian 320-MS LC/MS/MS (Abb. 1) zeigte die Methode gute Linearität, hohe Empfindlichkeit und stabile Ionenverhältnisse zur Identifikation. Nachweisgrenzen von 10 ppb können leicht erreicht werden.

 


Materialien und Reagenzien

EtG und D5-EtG wurden von Lipomed bezogen. Eine EtG-Stammlösung in Methanol/Wasser (5 %/95 %) wurde in einer Konzentration von 1,0 mg/ml hergestellt. Eine Lösung des internen Standards wurde im gleichen Lösungsmittel in einer Konzentration von 0,1 mg/ml hergestellt.

Verdünnungen des Standards wurden in den Konzentrationen 100 ppm, 10 ppm, 1 ppm, 100 ppb, 50 ppb und 10 ppb hergestellt und mit internem Standard versetzt. Für Matrix-Tests wurde Urin mit EtG aufgestockt und dann mit Urin zu unterschiedlichen Konzentrationen verdünnt.

 


Diskussion

Die Methode stellt eine Variante der Direktinjektion dar, wie sie typischerweise in forensischen Laboratorien für die Analyse von EtG aus Urin angewandt wird. Die Direktinjektion sieht eine Zugabe von internem Standard und eine 10-fache Verdünnung ohne weitere Probenvorbereitung vor.

Abhängig von den Anforderungen an die Qualitätssicherung können für die Quantifizierung und Absicherung der Ergebnisse eine Reihe von Fragmentionen, bzw.

ihre Verhältnisse zueinander, genutzt werden, wie z. B. die Übergänge 221 -> 75, 221-> 85, 221 -> 159, 221 -> 203.

Wie in Abbildung 2 dargestellt, zeigen diese verschiedenen Massenübergänge unterschiedliche Empfindlichkeit. Abbildung 3 zeigt die Chromatogramme verschiedener EtG-Konzentrationen in Urin von zwei ausgewählten Massenübergängen. Die schnelle chromatographische Trennung wurde innerhalb von zwei Minuten erreicht.

Die Pursuit C18 Säule zeichnet sich durch stark reduzierte hydrophile Eigenschaften aus, die durch modernste Bonding-Technologie auf ultrahochreinem Kieselgel erreicht werden.

In diesem Fall konnten alle störenden Komponenten aus der Matrix abgetrennt und in den Abfall geleitet werden. Negative Einflüsse der Matrix auf den Analyten wurden so minimiert. Abbildung 4 zeigt eine 5-Punkte Kalibrierkurve mit guter Linearität von 10 ppb bis 10 ppm mit einem r2 größer als 0.999.

 


Zusammenfassung

Für die Analyse von EtG aus Urin konnte unter Benutzung von Pursuit C18 HPLC Säulen und dem Varian 320-MS LC/MS/MS eine schnelle, effiziente, kostengünstige und empfindliche Methode entwickelt werden, welche allen Anforderungen der Analytik gerecht wird.

 

HPLC-Bedingungen

Säule: Pursuit C18 5 μm, 50 x 4.6 mm ID
(Varian Art. Nr. A3000050X046)
Vorsäule: Polaris C18-A 5 μm, 10 x 4.6 mm ID
(Varian Art. Nr. A2000010D046)
Mobile Phase: A: H2O +0,1 % HCOOH
B: CH3CN
A:B - 95:5 (isokratisch)
Flussrate: 0,7 ml/min
Temperatur: Raumtemperatur

 


MS Parameter

ESI negative
API Drying Gas 35 psi, 380 ºC
API Nebulizing Gas 60 psi
Shield -600V
Collision gas 2.0 mTorr (Ar)
Needle -4.000 V
Capillary Voltage 40 V
Detector 1.350 V

 


Literatur

1. Wurst, F. M.; Skipper, G. E.; & Weinmann, W. "Confirmatory Analysis of Ethylglucuronide in Urine by Liquid-Chromatography/Electrospray Ionization/Tandem Mass Spectrometry According to Forensic Guidelines", Journal of The American Society for Mass Spectrometry, 15, 188-193, (2004).

 


Kontakt

Eugene Chang
Justin Chang
Ritu Arora

Varian, Inc.
Dr. Susanne Sölter
Dr. Georg Kneer
Varian Deutschland GmbH,
Darmstadt
Tel.: 06151/703-0
Fax: 06151/703237
de.info@varianinc.com

 

 

 

 

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