Automatisierte Massenbestimmung nach Dünnschichtchromatographie

DC-MS-Kopplung: Jetzt einfach und schnell

  • Automatisierte Massenbestimmung nach Dünnschichtchromatographie - DC-MS-Kopplung: Jetzt einfach und schnell (© macosx - Fotolia.com)Automatisierte Massenbestimmung nach Dünnschichtchromatographie - DC-MS-Kopplung: Jetzt einfach und schnell (© macosx - Fotolia.com)
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  • Abb. 2: Einwaagen für die Suzuki-Kupplung. Die Substanzen A und B wurden in äquimolarem Verhältnis bei Raumtemperatur gemischt und jeweils 2 µL dieser Reaktionsmischung wurden nach der angegebenen Reaktionszeit auf eine DC-Platte gegeben.
  • Abb. 3: Das Edukt (4-Bromanilin) und das Suzuki-Reaktionsprodukt (4-Aminobiphenyl) wurden jeweils mit ihrer protonierten Masse bei 171,9 und 170,1 m/z detektiert. A) XIC des Produkts (4-Aminobiphenyl) bei 170,1 m/z zu unterschiedlichen Reaktionszeitpunkten von 0 bis 180 min. B) Massenspektrum des Produkts 170 m/z nach 120 min C) XIC des Edukts (4-Bromanilin) bei 171,9 m/z zu unterschiedlichen Reaktionszeitpunkten von 0 bis 180 min. D) Massenspektrum des Edukts (4-Bromanilin).
  • Abb. 4: SIM (Selected Ion Monitoring) DC-MS-Analyse von  Chilipulverextrakt, das mit sieben Sudanfarbstoffen versetzt wurde (jeweils 1 µl mit 0,5 ng Farbstoffsubstanz wurden auf eine DC Platte aufgetragen) A) Sudan II (277,1 m/z) B) Sudan Rot 7B (380,1 m/z) C) Sudan I (249,1 m/z) D) Sudan IV (381,1 m/z) E) Sudan III (353,2 m/z) F) Sudan Rot G (279,1 m/z) G) Sudan Orange G (215,1 m/z).

Automatisierte Kombi-Geräte von Dünnschichtchromatographie (DC) und Massenspektrometrie (MS) sind jetzt verfügbar und werden in den nächsten Jahren eine deutlich beschleunigte Verbreitung des Verfahrens ermöglichen. Insbesondere Anwender mit Interesse am Monitoring von chemischen Synthesereaktionen sowie Labore der Lebensmittelchemie und Naturstoffanalytik werden davon profitieren.

Die Dünnschichtchromatographie (DC) ist eine sehr gut etablierte und vielfach genutzte Separationstechnik. Sie verbindet eine schnelle Substanztrennung mit hoher Auflösung bei geringem apparativem Aufwand unter Einsatz niedriger Substanzmengen. Wichtige Anwendungsbereiche sind u. a. das Monitoring von chemischen Synthesereaktionen sowie zahlreiche Anwendungen in der Lebensmittelchemie und das vergleichende Screening von Naturstoffkomponenten. Für Analysen, die über die optische Betrachtung (oftmals unter UV-Licht zur Fluoreszenzanregung) oder die densitometrische Auswertung der Separationszonen hinausgehen, müssen die getrennten Komponenten aus der Matrix extrahiert werden. Das Plate Express-Interface ermöglicht es, die Extraktion und die Überführung der gelösten Komponenten in ein Massenspektrometer zur Ermittlung der Molekulargewichte automatisiert durchzuführen. Der Nutzen der Massenspektrometrie für diesen Anwendungsbereich ist zwar bekannt [1-4], hohe Anschaffungskosten und die komplizierte Bedienung der Geräte behinderten in der Vergangenheit jedoch eine weitere Verbreitung der Methodik. Mit dem ebenfalls von Advion hergestellten expression CMS (compact mass spectrometer) steht nun seit einigen Jahren ein vergleichsweise preisgünstiges und vor allem sehr leicht zu bedienendes System zur Verfügung. Beide Komponenten sind aufeinander abgestimmt und werden über eine gemeinsame Steuersoftware kontrolliert. Im Folgenden wird die direkte Kopplung von Dünnschichtchromatographie und Massenspektrometrie an zwei ausgewählten Beispielen erläutert.

Technischer Ablauf der Extraktion

Nach Einlegen der DC-Platte in das Interface wird die ausgewählte Separationszone mit Hilfe eines Lasers korrekt positioniert (Abb.

1) und der Vorgang gestartet. Ein Stempel senkt sich auf die DC-Platte und umschließt eine Fläche von 2x4 mm, wobei ein Drucksensor unnötigen Materialverschleiß durch zu hohen Anpressdruck verhindert. Anschließend wird der Lösungsmittelfluss durch den Elutionskopf des Stempels über eine HPLC-Pumpe in Gang gesetzt. Die gelösten Komponenten werden über Kapillaren in das Massenspektrometer befördert, wobei eventuell vorhandene partikuläre Verunreinigungen durch eine Fritte zurückgehalten werden. Nach Abschluss der Extraktion erfolgt eine automatische Reinigung durch Rückfluss-Spülung und Ausblasen mit Stickstoff. Damit ist gewährleistet, dass ein Übertragen extrahierter Komponenten oder Verunreinigungen von Extraktion zu Extraktion so weit wie möglich verhindert werden. Der gesamte Vorgang benötigt weniger als zwei Minuten.

Überwachung des Reaktionsfortschritts am Beispiel einer Suzuki-Kupplung

Die Suzuki-Kupplung ist eine in der organischen Chemie häufig durchgeführte Reaktion, bei der Halogene mit Boronsäuren unter Palladiumkatalyse umgesetzt werden, um Aromaten miteinander zu verbinden [5]. In dem gewählten Beispiel wird 4-Bromanilin mit Phenylboronsäure zu 4-Aminobiphenyl umgesetzt (Abb. 2).

Der Verlauf der Reaktion lässt sich mit Hilfe der DC-MS-Kopplung kontrollieren. Nach 0, 10, 15, 20, 40, 60, 120 und 180 min wurden Proben aus der Reaktionsmischung entnommen und auf eine DC-Platte aufgetragen. Die DC-Platte wurde mit dem Laufmittel Benzol entwickelt und die Separationszonen unter UV-Licht (254 nm) mit einem Bleistift markiert. Das Produkt 4-Aminobiphenyl befindet sich bei einem Retentionsfaktor (Rf-Wert) von 0,1 und das Edukt 4-Bromanilin bei 0,15. Als Lösungsmittel zur Extraktion wurde Methanol mit 0,1 % Ameisensäure verwendet. Die Aufnahme der Massenspektren erfolgte im positiven Modus mit einer APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation)-Ionenquelle. Der Verlauf der Reaktion kann semi-quantitativ nachvollzogen werden. In Abb. 3 sind dafür die XIC (eXtracted Ion Chromatogramm)-Werte des Produkts (4-Aminobiphenyl) und des Edukts (4-Bromanilin) aufgetragen. Mit Hilfe des Massenspektrums lassen sich die Separationszonen dem jeweiligen Produkt und Edukt zuordnen. In der Abb. 3B ist ausschließlich die protonierte Masse des Produkts bei m/z 170,1 und sein Methanol-Addukt bei m/z 202,1 zu sehen. Es ist hier kein Edukt nachzuweisen, was eine vollständige DC-Trennung belegt. Umgekehrt gilt das Gleiche für das Edukt-Spektrum (Abb. 3D). Hier sind nur die Signale des protonierten Edukts bei 171,9 m/z 79Br und 173,9 m/z 81Br) zu sehen. Aus den Ergebnissen lässt sich also eindeutig die Zunahme des Produkts bei gleichzeitiger Abnahme des Edukts erkennen. Der Fortschritt einer Reaktion kann somit schnell und zuverlässig verfolgt werden.

Analyse komplexer Mischungen am Beispiel von Sudanfarbstoffen

Sudanfarbstoffe gehören zur Gruppe der Azofarbstoffe und können im Körper in karzinogene Amine gespalten werden. Sie sind als Nahrungsmittelzusätze verboten. Es werden allerdings immer wieder Sudanfarbstoffe in importierten Lebensmitteln nachgewiesen. So haben beispielsweise im Jahr  2003 Labore verschiedener Staaten der Europäischen Union in Proben von scharfem Chilipulver aus Indien die verbotenen Farbstoffe Sudan I-IV nachgewiesen [6]. Ein Chilipulverextrakt, welcher keine  Sudanfarbstoffe enthielt, wurde mit 0,5 ng/µL von insgesamt sieben Sudanfarbstoffen angereichert. Diese Mischung wurde auf eine DC-Platte aufgetragen und entwickelt. Als Laufmittel wurde Ethylacetat und Hexan (15/85, v/v) verwendet. Die separierten Spots wurden mit einer Mischung aus Methanol und Acetonitril (50/50, v/v) mit 0,1 % Ameisensäure extrahiert. Die Massenspektren wurden im positiven Modus mit einer APCI-Quelle aufgenommen. In Abb. 4 sind die Massenspektren der einzelnen Spots dargestellt. Der Spot mit einem Rf-Wert von etwa 0,75 enthält die Massen 380,1, 249,1 und 381,1 m/z. Diese Werte entsprechen den Farbstoffen Sudan Rot 7B, Sudan I und Sudan IV. Die drei Farbstoffe konnten nicht vollständig getrennt werden und erst die massenspektrometrische Analyse ermöglichte die eindeutige Identifizierung dieser Substanzen, ein weiterer Hinweis auf die Vorteile der MS-Analyse.

Zusammenfassung

Die Kombination von Dünnschichtchromatographie (DC) und Massenspektrometrie (MS) liefert wertvolle Daten für ein zuverlässiges Monitoring von chemischen Synthesereaktionen und für zahlreiche weitere Anwendungen in der Lebensmittelchemie und Naturstoffanalytik. Die automatisierte Durchführung des Verfahrens mit preislich vertretbaren und auch für Nicht-Experten leicht zu bedienenden Geräten ist jetzt ebenfalls ermöglicht. Die Hürden zur Integration der DC-MS-Kopplung im chemischen Labor sind also deutlich niedriger als noch vor wenigen Jahren. Für die nahe Zukunft ist daher mit einer beschleunigten Verbreitung der DC-MS-Kopplung zu rechnen.

Literatur
[1] Cheng, S.C. et al.: Chromatogr. A 1218(19), 2700–2711 (2010)
[2] Van Berkel, G.J. et al.: Anal. Chem. 79(7), 2778–2779 (2007)
[3] Henion, J. et al.: J. Chromatogr. 271(1), 107–124 (1983)
[4] Van Berkel, G.J  et al.: Anal. Chem. 1207–1215 (2005)
[5] Laue, T. und Plagens A.: Namen- und Schlagwortreaktionen, Teubner, 1998, 307 ff.
[6] Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), Farbstoffe Sudan I bis IV in Lebensmitteln, Stellungnahme des BfR vom 19. November 2003

Autoren
Dr. Christine Merkert,
Field Marketing Specialist Central Europe, Advion
Frank Porbeck, Support Manager Central Europe, Advion
Maik Soddemann, Field Service Specialist Central Europe, Advion
Dr. Andreas Wiesner, PD, Director Sales Central Europe, Advion

Kontaktieren

Advion LTD.
Kao Hockham Bldg., Edinburgh Way
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GB

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