Chemische Vernetzung in Kombination mit Massenspektrometrie

Eine praktische Anleitung für die Proteinstrukturanalyse

  • Abb. 1: Arbeitsschritte eines chemischen Protein-Vernetzung/MS-Experiments. 1. Chemische Vernetzungsreaktion der Proteine, 2. Eindimensionale Gelelektrophorese (SDS-PAGE) des vernetzten Proteingemisches, 3. Enzymatische Proteolyse, entweder im Gel oder in der Lösung, 4. Anreicherung der vernetzten Peptide mittels Größenausschlusschromatographie (SEC), 5. Flüssigkeitschromatographie/Tandem-Massenspektrometrie (LC/MS/MS) der Peptidgemische, 6. Datenanalyse mittels MeroX-Software und Ableitung von Distanzinformationen, 7. Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und 3D-Struktur-Modellierung von Proteinen.Abb. 1: Arbeitsschritte eines chemischen Protein-Vernetzung/MS-Experiments. 1. Chemische Vernetzungsreaktion der Proteine, 2. Eindimensionale Gelelektrophorese (SDS-PAGE) des vernetzten Proteingemisches, 3. Enzymatische Proteolyse, entweder im Gel oder in der Lösung, 4. Anreicherung der vernetzten Peptide mittels Größenausschlusschromatographie (SEC), 5. Flüssigkeitschromatographie/Tandem-Massenspektrometrie (LC/MS/MS) der Peptidgemische, 6. Datenanalyse mittels MeroX-Software und Ableitung von Distanzinformationen, 7. Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und 3D-Struktur-Modellierung von Proteinen.
  • Abb. 1: Arbeitsschritte eines chemischen Protein-Vernetzung/MS-Experiments. 1. Chemische Vernetzungsreaktion der Proteine, 2. Eindimensionale Gelelektrophorese (SDS-PAGE) des vernetzten Proteingemisches, 3. Enzymatische Proteolyse, entweder im Gel oder in der Lösung, 4. Anreicherung der vernetzten Peptide mittels Größenausschlusschromatographie (SEC), 5. Flüssigkeitschromatographie/Tandem-Massenspektrometrie (LC/MS/MS) der Peptidgemische, 6. Datenanalyse mittels MeroX-Software und Ableitung von Distanzinformationen, 7. Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und 3D-Struktur-Modellierung von Proteinen.
  • Abb. 2: A) Das Vernetzungsreagens DSBU besitzt als funktionelle Gruppen zwei N-Hydroxysucci- nimid-Ester, die bevorzugt mit Aminen reagieren. B) Photo-Methionin wird in die Proteine während der Proteinbiosynthese in Zellen eingebaut. Nach der Aktivierung mit UV-Strahlung ist eine Reaktion mit allen Aminosäuren in räumlicher Nähe möglich.
  • Abb. 3: Fragmentierung von DSBU (A) und Photo-Methionin (B). (A) Die zentrale Harnstoffgruppe von DSBU ist in Tandem-MS-Experimenten spaltbar. So entstehen für beiden vernetzten Peptide α und β jeweils zwei charakteristische Fragmente („Dubletts“) mit einer Massendifferenz von 26 u. Diese erleichtern die automatische Identifizierung der verknüpften Peptide mittels der MeroX-Software. (B) Bei der Reaktion von Photo-Methionin mit sauren Aminosäuren entsteht eine MS-labile Esterbindung, die in Tandem-MS-Experimenten ein charakteristisches Signalpaar mit einer Massendifferenz von 28 liefert.

Die chemische Vernetzung gewinnt als Methode zur Strukturaufklärung von Proteinen und Proteinkomplexen zunehmend an Bedeutung. In Kombination mit der Massenspektrometrie (MS) bildet sie einen überaus erfolgreichen Ansatz, der komplementäre Informationen zu den klassischen, hochauflösenden Methoden der Proteinstrukturanalyse wie der Röntgenkristallographie und NMR-Spektroskopie liefert (1). Eine wichtige Anwendung der Kombination aus der chemischen Vernetzung von Proteinen mit MS besteht, neben der Gewinnung von Strukturinformationen gereinigter Proteine, in ihrem Einsatz für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellen, Gewebe und in Organismen (2, 3). Die Vorteile der Methode liegen in ihrer Sensitivität, die den Nachweis von Proteinen im Femtomol-Bereich erlaubt, sowie in der Möglichkeit, native Proteinstrukturen zu studieren.

Die chemische Vernetzung von Proteinen erfolgt mithilfe von Reagenzien, die aufgrund ihrer spezifischen Reaktivität funktionelle Gruppen von Aminosäureseitenketten in einer geeigneten, räumlichen Distanz kovalent miteinander verknüpfen. Die Entfernung zwischen den Aminosäuren wird hauptsächlich durch die Länge des Abstandshalters („Spacer“) definiert, der zwischen den beiden reaktiven Gruppen des Vernetzungsreagenz liegt. Aus diesem Grund kann das entsprechende Verknüpfungsreagenz auch als „molekulares Lineal“ bezeichnet werden. Die erhaltenen Distanzinformationen zwischen den vernetzten Aminosäuren werden anschließend zur computerbasierten Modellierung von Proteinen und deren Komplexen mit Bindungspartnern eingesetzt. Im Folgenden wird ein Protokoll beschrieben, das die wichtigsten Arbeitsschritte der Protein-Vernetzung/MS-Methode beschreibt (Abb. 1) (4).
 
Chemische Vernetzung der Proteine
Die chemische Vernetzung der Proteine erfolgt in Lösung. Hierzu wird ein Vernetzungsreagenz, wie beispielsweise Disuccinimidyldibutanoylharnstoff (DSBU) (Abb. 2A) in einem Überschuss zum Protein hinzugegeben. Photo-reaktive Aminosäuren, wie Photo-Methionin, die z.B. eine Diaziringruppe enthalten, werden in E. coli-Zellen bereits während der Proteinbiosynthese eingebaut und anschließend für die Vernetzung mit UV-Bestrahlung aktiviert (Abb.

2B). DSBU verknüpft vorrangig Lysine miteinander, jedoch besitzt es auch eine Reaktivität gegenüber Hydroxygruppen, wie sie in den Aminosäuren Tyrosin, Threonin und Serin vorkommen. Im Verknüpfungsreagenz DSBU liegen die beiden reaktiven Gruppen in einem Abstand von 12,5 Å vor, wodurch in Proteinen Cα-Cα-Abstände von bis zu 30 Å überbrückt werden können. Demgegenüber hat Photo-Methionin zwar eine gewisse Präferenz gegenüber sauren Aminosäuren, wie Glutaminsäure und Asparaginsäure, doch reagiert es prinzipiell mit allen 20 proteinogen Aminosäuren. Photo-Methionin bildet direkt kovalente Bindungen mit funktionellen Gruppen in Aminosäuren aus, die sich in nächster Nähe (unter 8 Å) befinden. Somit können mit Photo-Methionin kürzere Abstandsinformationen im Vergleich mit DSBU erhalten werden.

 
Analyse der Vernetzungsprodukte mit eindimensionaler Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Der erfolgreiche Verlauf der Vernetzungsreaktion kann mittels eindimensionaler Gelelektrophorese (Natriumdodecylsulfat-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese, SDS-PAGE) überprüft werden, indem das vernetzte Proteingemisch getrennt und visualisiert wird. Hier besteht die Möglichkeit einer Optimierung der Reaktionsbedingungen. Die Signale der Proteine oder Proteinkomplexe von Interesse können aus dem Gel für eine nachfolgende enzymatische in-Gel-Proteinspaltung ausgeschnitten werden.
 
Enzymatische Proteinspaltung
Entweder erfolgt die enzymatische Protein-spaltung unmittelbar in der Gelmatrix oder direkt in der Proteinlösung. Nach Reduktion der Disulfidbrücken und anschließender Alkylierung der Proteine erfolgt die Proteinspaltung meist mit Hilfe der Protease Trypsin, die das Protein C-terminal an den Aminosäuren Lysin und Arginin spaltet. Die erhaltenen Peptidgemische werden anschließend mit massenspektrometrischen Methoden (vor allem Flüssigkeitschromatogrpahie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie, LC/MS/MS) analysiert und auf vernetzte Peptide hin untersucht. Befinden sich die vernetzten Peptide aufgrund eines zu hohen Molekulargewichts nicht im optimalen MS-Detektionsbereich, wird zusätzlich eine weitere Protease, wie beispielsweise GluC, verwendet, die Proteine C-terminal an Glutaminsäure- und Asparaginsäure-Resten spaltet. Nach der enzymatischen Spaltung liegt ein hochkomplexes Gemisch von nicht vernetzten und vernetzten Peptiden vor. Diese liefern die gewünschten Abstandsinformationen zur Ableitung von dreidimensionalen Strukturinformationen der untersuchten Proteine.
 
Anreicherung der Vernetzungsprodukte
Um die massenspektrometrische Analyse der meist nur in geringer Menge vorliegenden Vernetzungsprodukte zu erleichtern, kann als nächster Schritt eine Anreicherung der vernetzten Peptide hilfreich sein. Hier sind verschiedene Strategien möglich, die darauf basieren, dass die vernetzten Peptide einen größeren Radius oder einen höheren isoelektrischen Punkt als lineare Peptide aufweisen. Deshalb können die Größenausschlusschromatographie oder die Kationen-Austauschchromatographie angewendet werden. Nach der Anreicherung liegen allerdings meist mehrere Fraktionen vor, die nacheinander mit MS analysiert werden müssen.
 
Massenspektrometrische Analyse
Die Analyse der vernetzten Peptidgemische wird durch die Kopplung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit der Tandem-Massenspektrometrie (LC/MS/MS) durchgeführt. Nach der weiteren Auftrennung der komplexen Peptidgemische durch die Umkehrphasen (Reversed Phase, RP)-Chromatographie werden zunächst die Massen der intakten vernetzten Peptide mit hoher Massengenauigkeit bestimmt, bevor sie im Massenspektrometer fragmentiert werden (MS/MS oder Tandem-MS). Durch die Fragmentierung werden die Aminosäuresequenzen der vernetzten Peptide abgeleitet. Das Vernetzungsreagenz DSBU ist aufgrund seines zentralen Harnstoffmotivs ein MS-spaltbares Verknüpfungsreagenz (Abb. 3). Die zentrale Harnstoffgruppe besteht aus zwei labilen NH–CO-Bindungen (gekennzeichnet durch gelbe Pfeile in Abb. 3A), die sich im Massenspektrometer mit ähnlicher Energie wie die Amidbindungen des Peptidrückgrates spalten lassen. Bei der Reaktion mit den sauren Aminosäuren Glutaminsäure und Asparaginsäure bildet Photo-Methionin eine Esterbindung aus, die ebenfalls im Massenspektrometer gespalten werden kann (Abb. 3B). Die so entstehenden Fragmente liefern somit charakteristische Muster in den MS/MS-Spektren, was eine vollautomatische Computer-gestützte Datenauswertung ermöglicht.
 
Datenanalyse
Die Datenauswertung erfolgt mit der frei erhältlichen Software MeroX und basiert, wie bereits erwähnt, auf der Identifizierung der charakteristischen Fragmente von MS-spaltbaren Vernetzungsreagenzien, wie DSBU und Photo-Methionin (Abb. 3). Bei DSBU wird in Tandem-MS-Experimenten die Spaltung jeweils einer der beiden NH–CO-Bindungen der zentralen Harnstoffgruppe erzeugt, sodass spezifische Signale für die beiden verknüpften Peptide entstehen, die einen Teil des Linkers, entweder mit oder ohne Carbonylgruppe (rot markiert), enthalten. Hieraus resultiert für jedes Peptid jeweils ein „Dublett“ an massenspektrometrischen Signalen mit einer Massendifferenz von 26 u für DSBU. Für Photo-Methionin entsteht ein Signalpaar mit einer Massendifferenz von 28 u, das die automatische Datenauswertung erlaubt.
 
Fazit
In der Strukturbiologie rückt die Kombination der chemischen Vernetzung mit MS immer mehr in den Fokus. Das hier vorgestellte Protokoll fand bereits bei einer Vielzahl von Vernetzungsexperimenten erfolgreich Anwendung, sowohl für gereinigte Proteine, als auch für die Aufklärung von Protein-Netzwerken in Em-bryonen der Fruchtfliege Drosophila melanogaster (5). Die bei diesem Arbeitsablauf erhaltenen Vernetzungsprodukte liefern sowohl Aussagen über die Natur von Protein-Wechselwirkungen in Zellen oder Organismen und geben darüber hinaus Einblicke in die dreidimensionalen Strukturen der Proteine. Die Kombination der chemischen Vernetzung mit MS erlaubt zusammen mit anderen Methoden der Proteinstrukturanalyse, wie der NMR-Spektroskopie, der Kristallographie und der Kryo-Elektronenmikroskopie, detaillierte Einblicke sowohl in die Raumstrukturen von Proteinen, als auch in das Zusammenspiel von Proteinen in ihrer zellulären Umgebung.
 
 
Autoren
Anne Rehkamp1 und Andrea Sinz1
 
Zugehörigkeit
1Abteilung für Pharmazeutische Chemie & Bioanalytik, Institut

 

Kontakt   
Prof. Dr. Andrea Sinz

Abteilung für Pharmazeutische
Chemie & Bioanalytik
Institut für Pharmazie
Martin-Luther-Universität
Halle-Wittenberg
Halle/Saale, Deutschland
andrea.sinz@pharmazie.uni-halle.de
http://agsinz.pharmazie.uni-halle.de

 

Weitere Beiträge zum Thema

 

Literatur

1. Sinz A. Cross-linking/Mass spectrometry for studying protein structures and protein-protein interactions: Where are we now and where should we go from here?, Angew Chem Int Ed Engl. 2018;57(22):6390-6.

2. Chavez JD, Lee CF, Caudal A, Keller A, Tian R, Bruce JE. Chemical crosslinking mass spectrometry analysis of protein conformations and supercomplexes in heart tissue. Cell Syst. 2018;6(1):136-41 e5.

3. Liu F, Rijkers DT, Post H, Heck AJ. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 2015;12(12):1179-84.
4. Iacobucci C, Gotze M, Ihling CH, Piotrowski C, Arlt C, Schafer M, et al. A cross-linking/mass spectrometry workflow based on MS-cleavable cross-linkers and the MeroX software for studying protein structures and protein-protein interactions. Nat Protoc. 2018;13(12):2864-89.
5. Götze M, Iacobucci C, Ihling CH, Sinz A. A Simple Cross-Linking/Mass Spectrometry Workflow for Studying System-wide Protein Interactions. Anal Chem. 2019;91(15):10236-44.

 

 

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