Chip-Kalorimetrie zur Detektion der metabolischen Aktivität lebender Zellen

Optimierte Methode mit viel Potential

  • Abb. 1: Schematische Darstellung eines Chip-Bauelements (A) zur Messung von Wärme-leistungen (Kalorimeter-Chip). Die Thermosäule (Thermopile) wandelt die generierte Tempe-raturdifferenz ΔT(t) in ein Spannungssignal u(t). Beispiel eines Kalorimeter-Chips mit Messkammer ist in (B) dargestellt (IPHT Jena, Baier 2005).Abb. 1: Schematische Darstellung eines Chip-Bauelements (A) zur Messung von Wärme-leistungen (Kalorimeter-Chip). Die Thermosäule (Thermopile) wandelt die generierte Tempe-raturdifferenz ΔT(t) in ein Spannungssignal u(t). Beispiel eines Kalorimeter-Chips mit Messkammer ist in (B) dargestellt (IPHT Jena, Baier 2005).
  • Abb. 1: Schematische Darstellung eines Chip-Bauelements (A) zur Messung von Wärme-leistungen (Kalorimeter-Chip). Die Thermosäule (Thermopile) wandelt die generierte Tempe-raturdifferenz ΔT(t) in ein Spannungssignal u(t). Beispiel eines Kalorimeter-Chips mit Messkammer ist in (B) dargestellt (IPHT Jena, Baier 2005).
  • Abb. 2: Verlauf der Wärmeproduktion einer S. aureus – Kultur, die mit Bakteriophagen infiziert ist.
  • Abb. 3: Verlauf der Wärmeproduktion eines P. putida- Biofilms bei Behandlung mit dem Antibiotikum Kanamycin (8 mg l-1).
  • Abb. 4: Wärmeproduktion von Zebrafisch-Embryos (Danio rerio) 24 – 27 Stunden nach Befruchtung.

Chip-Kalorimetrie ist eine thermophysikalische Methode, die in ihren Anfängen hauptsächlich für die Untersuchung von Stoffeigenschaften und Phasenänderungen bei extrem hohen Aufheizgeschwindigkeiten eingesetzt wurde. In letzter Zeit konnte die Detektionsgrenze dieser Kalorimeter bis auf wenige Nanowatt abgesenkt werden, so dass die metabolische Wärmeproduktion mikrobiologischer Proben im Nano- und Mikroliterbereich mit hinreichender Auflösung messbar ist. Damit ist das Potential der Methode, Änderungen im Metabolismus der Untersuchungsobjekte z. B. durch Inhibierung oder Aktivierung in Echtzeit und zerstörungsfrei zu erfassen, praktisch zugänglich.

Die Aufklärung von Lebensprozessen in Mikroorganismen und isolierten Zellen mit Hilfe moderner molekular-biologischer Methoden verlangt in der Regel ein erhebliches Maß an Vorinformation. Die Identifizierung definierter Gene in bakteriellen Keimen mittels PCR steht z. B. eben nur für eine ganz bestimmte Antibiotika-Resistenz und bei GFP-Markierungen steht vorher fest, welche Proteine untersucht werden sollen. Demgegenüber ist die Wärmeproduktion eines Organismus ein sehr unspezifisches Maß für dessen Aktivität. Es ist absolut global und vermittelt Änderungen im Metabolismus, ohne dass Vorstellungen über deren Natur und Ursache bestehen müssen. Die geringe analytische Spezifität wird besonders dann zum Vorteil, wenn in komplexen Systemen, wie es lebende Organismen sind, unbekannte Phänomene erkannt werden sollen (Wadsö, 1988). So gesehen, müsste die Kalorimetrie - das ist die entsprechende Messmethode - ideal sein für ein erstes Screening von z. B. pharmazeutischen Wirkstoffen und deren Effekt auf Mikroorganismen und Mehrzeller. Zumal, und das ist sicherlich eine herausragende Eigenschaft der Methode, Wärmeleistung ein gut quantifizierbares Maß für die Geschwindigkeit ablaufender Stoffwechselprozesse ist, sehr schnell und zerstörungsfrei gemessen werden kann und damit in gewisser Weise eine Art Schnappschuss der aktuellen metabolischen Aktivität des gerade untersuchten biologischen Objekts liefert.

Kalorimetrie an Lebewesen

Die Erkenntnis, Kalorimetrie für die Quantifizierung metabolischer Prozesse zu nutzen, ist nicht neu.

Erfolgreiche Beispiele für die Kalorimetrie an Lebewesen gibt es seit Jahrzehnten. Erheblicher Probenbedarf, geringer Messdurchsatz, großer Betriebsaufwand und hohe Kosten haben jedoch bisher eine breite Nutzung der Methode im medizinisch-diagnostischen und bio-chemischen Bereich verhindert. Neue Möglichkeiten ergeben sich mit der Einführung der sog. Chip-Kalorimetrie, einem Gebiet, auf dem der Verfasser seit Jahren engagiert ist.

Bekannte Chip-Kalorimeter

Kalorimeter, bei denen wesentliche Funktionselemente wie Probenträger, Temperatursensoren, Kalibrierheizer und definierte Wärmeleitstrecken in einem Bauelement, in der Regel einem Silizium-Chip integriert sind, bezeichnet man als Chip-Kalorimeter. Derartige Kalorimeter werden immer dann vorteilhaft eingesetzt, wenn die Wärmeleistung in kleinen nl- bis µl-Proben gemessen werden soll und/oder wenn die Untersuchung extrem schell ablaufender Prozesse bzw. ein hoher Probendurchsatz je Zeiteinheit gewünscht sind. Zudem erlaubt die Verwendung integrierter Bauelemente eine kostengünstige Fertigung.
Wesentlich für das Design eines Kalorimeter-Chips (s. Abb. 1) ist eine wenige Nanometer bis einige 10 µm dicke Membran, die sowohl Träger der Probe ist, als auch Temperatursensoren und Heizerelemente als integrierte Strukturen enthält. Als Membranmaterial sind epitaktisches Silizium, Silizium-Oxinitrid aber auch Polymerfilme gebräuchlich. Die dünne Membran gewährleistet eine hinreichend gute thermische Isolation von Probe und Umgebung bei lateralen Abmessungen von wenigen Millimetern. Die geringe Masse der Membran ergibt zudem kleine thermische Zeitkonstanten, da diese im Wesentlichen nur durch die Wärmekapazität der Probe und den thermischen Widerstand der Membran bestimmt werden. Als Temperatursensoren werden vorrangig Thermosäulen, d. h. in Reihe geschaltete Dünnfilmthermoelemente verwendet, seltener Widerstandsthermometer in Form von Dünnfilm-Platinleiterbahnen oder Thermistoren. Integrierte Heizer können unter Umständen für die kalorimetrische Kalibrierung verwendet werden.

Optimierte Chip-Kalorimeter

In der Literatur sind Chip-Kalorimeter beschrieben, mit denen die Wärmeproduktion einzelner, isolierter tierischer Zellen, z. B. Zellen einer Mausleber, Zellen von Brown‘schem Fettgewebe oder Herzmuskelzellen, gemessen werden können (Johannessen, 2002; Xu, 2008). Derartige Zellen erzeugen eine Leistung von mehreren Nanowatt und sind deshalb mit besonders stark miniaturisierten Kalorimetern messbar. Das von Johannessen publizierte Chip-Kalorimeter nutzt ein Probenvolumen von 0,8 nl. Soll dagegen die Wärmeproduktion von Bakterienkulturen untersucht werden, sind wegen der deutlich geringen Leistung je Zelle (wenige Picowatt) Probenvolumina von einigen Mikrolitern erforderlich, wenn mit relevanten Zelldichten gearbeitet werden soll. Die vom Verfasser entwickelten Chip-Kalorimeter (Lerchner, 2006, 2008) sind für die Analyse bakterieller Kulturen optimiert und messen die Wärmeleistung in Probenvolumina von ca. 6 µl mit einer Auslösung von bis zu 10 nW. Mit diesen Kalorimetern können außer Mikroorganismen in Suspension auch solche gemessen werden, die an Substraten immobilisiert sind wie z. B. Bakterien in Biofilmen und an Magnetbeads angereicherte Bakterien. Messvolumina im Mikroliterbereich ermöglichen weiterhin Untersuchungen an kleinen Mehrzellern wie z. B. einzelnen Fischem­bryonen. Die nachfolgenden Beispiele sollen die Anwendungsmöglichkeiten derartiger Kalorimeter illustrieren.

Anwendungsfelder

Das erste Beispiel (Abb. 2) zeigt, wie in Echtzeit der Verlauf der Infektion einer Bakterienkultur (hier Staphylococcus aureus) durch Bakteriophagen verfolgt werden kann. Bakteriophagen sind Viren, die sehr spezifisch Bakterienzellen befallen, deren Metabolismus zugunsten der Produktion neuer Virenproteine umprogrammieren und letztendlich eine Zerstörung der Bakterien bewirken. Charakteristisch sind die als Bursts bezeichneten, periodisch auftretenden Peaks, die zeigen, dass der Biosynthesemechanismus der Bakterien auf Hochtouren läuft, um neues Virenmaterial zu generieren, und dann plötzlich zusammenbricht. Dabei wird die Zelle zerstört und neue Viren werden freigesetzt, die dann noch vorhandene Bakterien befallen, was darauf folgende Peaks zeigen.

In Abb. 3 ist der Verlauf der metabolischen Wärmeproduktion der Bakterien in einem Biofilm (Pseudomonas putida) während der Behandlung mit dem Antibiotikum Kanamycin dargestellt (Buchholz, 2010). Bei diesem Experiment wurde der Biofilm vor der Messung in der Messkammer kultiviert. Unmittelbar nach Beginn der Antibiotikabehandlung ist ein schneller Anstieg der Wärmeleistung zu erkennen. Dieser Effekt ist auf eine Aktivierung von Abwehrmechanismen in den Bakterienzellen zurückzuführen, die mit erhöhtem Energiebedarf verbunden sind. Danach kann der typische Verlauf einer Absterbekurve (killing kurve) beobachtet werden. Derartige Messungen sind für eine Optimierung von Desinfizierungsmaßnahmen der i. a. schwer bekämpfbaren Biofilme nützlich.

Die mittlere Wärmeproduktion von Zebrafisch-Embryonen (Danio rerio) wurde bestimmt, indem die Wärmeleistung in Abhängigkeit von der Anzahl der Embryonen in der Messkammer ermittelt wurde (Lerchner, 2008). Aus der in Abb. 4 dargestellten Korrelation ergibt sich eine mittlere Leistung von 300 nW. Die Methode erlaubt, insbesondere den Effekt solcher Wirkstoffe auf den Organismus der Embryonen in Echtzeit zu verfolgen, die einen Einfluss auf den Energiestoffwechsel haben. So kann man sehr gut die erhöhte Wärmeproduktion bei der Dosierung von Dinitrophenol messen, die durch die Entkopplung der ATP-Produktion hervorgerufen wird.

Zukunft der Methode

Inwieweit die Methode tatsächlich Eingang in die Praxis medizinisch-diagnostischer und bio-chemischer Labors finden wird, hängt nicht zuletzt auch von der erfolgreichen Lösung einiger noch bestehender methodischer Probleme ab. So ist zum einen die auf die erforderliche Objektmenge bezogene Empfindlichkeit in manchen Anwendungsfällen unbefriedigend. Weiterhin ist nach Wegen zu suchen, einen konkurrenzfähigen Probendurchsatz zu erreichen. Die Kombination von Chip-Kalorimetrie und Biomagnetischer Separation und die Implementierung der Segmented-Flow-Technik, an beidem wird zz. gearbeitet, verspricht in dieser Beziehung erhebliche Fortschritte.

Literatur ist direkt beim Autor zu erhalten.

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