Chromatographie: Trennsäulen in der analytischen HPLC

Stand der Technik und Empfehlungen

  • Der Artikel enthält zunächst einen Rückblick über die Entwicklung von Trennsäulen in der analytischen HPLC und als Schwerpunkte eine kritische Evaluierung des derzeitigen Säulenmarktes, Bemerkungen zur sinnvollen Säulencharakterisierung und Empfehlungen zur Auswahl von Säulen für den Anwender.Der Artikel enthält zunächst einen Rückblick über die Entwicklung von Trennsäulen in der analytischen HPLC und als Schwerpunkte eine kritische Evaluierung des derzeitigen Säulenmarktes, Bemerkungen zur sinnvollen Säulencharakterisierung und Empfehlungen zur Auswahl von Säulen für den Anwender.
  • Der Artikel enthält zunächst einen Rückblick über die Entwicklung von Trennsäulen in der analytischen HPLC und als Schwerpunkte eine kritische Evaluierung des derzeitigen Säulenmarktes, Bemerkungen zur sinnvollen Säulencharakterisierung und Empfehlungen zur Auswahl von Säulen für den Anwender.
  • Stefan Lamotte
  • Klaus K. Unger

Chromatographie - Dieser Quo vadis Artikel enthält zunächst einen Rückblick über die Entwicklung von Trennsäulen in der analytischen HPLC und als Schwerpunkte eine kritische Evaluierung des derzeitigen Säulenmarktes, Bemerkungen zur sinnvollen Säulencharakterisierung und Empfehlungen zur Auswahl von Säulen für den Anwender.

Der lange Weg zur selektiven, stabilen und vailidierten Trennsäule
Die wesentlichen Grundlagen für die Hochleistungs-Flüssigchromatographie (engl. High Performance Liquid Chromatography, abgekürzt HPLC) wurden in den Jahren von 1965 - 1985 erarbeitet. Im Mittelpunkt stand dabei die Entwicklung , Konstruktion und Produktion selektiver , reproduzierbarer und stabiler Trennsäulen mit hoher Effizienz sowie von leistungsfähigen Geräten, die es erlaubten, validierbare Trenn- und Analysenverfahren durchzuführen.

Die Säulen bestehen aus Stahlrohren und geeigneten Verschlüssen und sind mit porösen Kieselgelteilchen mit mittleren Teilchendurchmessern von 3 - 5 µm gepackt. An der Oberfläche der Teilchen sind n-Octadecylsilylgruppen chemisch gebunden. Die Materialien werden als Umkehrphasen bezeichnet und mit wässerigen organischen Lösemitteln bei Säulenvordrücken bis 400 bar betrieben.

In den 90'er Jahren gelang es, die Massenspekrometrie mit der HPLC zu koppeln. Es wurden massenspezifische Detektoren eingeführt neben den konzentrations-spezifischen photometrischen und anderen Detektoren. Dies führte zu einem neuen Innovationsschub und erweiterte den Anwendungsbereich der HPLC wesentlich.

Aufbauend auf vorangegangenen Arbeiten wurden von Waters 2004 erstmals Säulen mit Umkehrphasen gepackt mit sub- 2 µm Teilchen, sogenannten UPLC-Säulen auf den Markt gebracht, die bis zu einem Druck von 1500 bar betrieben werden und schnelle Analysen erlauben. Das Konzept wurde mit dem Begriff Ultra HPLC (bzw. UPLC) vermarktet. Parallel dazu wurden von Merck erstmals monolithische Kieselgelsäulen entwickelt und kommerzialisiert, die schnelle Trennungen bei geringen Säulenvordrücken erlauben.

Die ersten HPLC-Säulen in den 1970'er Jahren waren mit 30 - 40 µm Teilchen gepackt, die einen unporösen Kern enthielten und mit einer dünnen porösen Schicht überzogen waren, sogenannten porous layer beads oder superficially porous beads.

Auf diesem Prinzip aufbauend, wurden 2006 erstmals Teilchen mit unporösen 1 - 2 µm Silica-Teilchen mit einer etwa 0,5 µm porösen Schicht hergestellt und diese 2,7 µm Core/Shell Teilchen als Umkehrphasen/Säulen in den Handel gebracht.

Die HPLC bietet heute eine Fülle von Möglichkeiten, einfache bis komplexe Stoffgemische schnell, reproduzierbar und mit hoher Empfindlichkeit zu trennen und zu analysieren und das in nahezu allen Anwendungsbereichen. Bei einem Säulenmarkt mit über 1 000 Umkehrphasen und zahllosen Gerätekonfigurationen bleibt für den Anwender allerdings die Frage nach der Wahl einer geeigneten Methode zur Lösung seines spezifischen Problems offen. Hier helfen einerseits die HPLC-Firmen, zum anderen Beraterfirmen, die Kurse oder Software anbieten, um optimale Lösungen zu erarbeiten. Im Hinblick auf die Erarbeitung praktikabler Lösungen von Trennproblemen gib es nach wie vor einen riesigen Bedarf an Information. Die Situation wird noch dadurch verschärft, dass es, im Gegensatz zu vorangegangenen Jahrzehnten, kaum eine Ausbildung in diesem Bereich an Hochschulen und Forschungseinrichtungen mehr gibt.

In diesem Artikel wird von zwei Autoren, die bei der Entwicklung der HPLC insbesondere von Trennsäulen über lange Jahre aktiv tätig waren, der Versuch unternommen, eine Reihe von wesentlichen und aktuellen Fragen auf diesem Gebiet zu beantworten.

Der HPLC Säulenmarkt: Wo stehen wir heute? Wo liegt das Potential von Trennsäulen, gepackt mit sub-2µm Partikeln?
Hier spielen zwei Aspekte eine Rolle. Der erste bezieht sich auf die Materialseite. Vollporöse Kieselgelteilchen mit mittleren Teilchendurchmessern von kleiner als zwei Mikrometern (µm) sind technologisch nur sehr aufwendig herzustellen, zu sichten und vor allem zu handhaben. Das Fließverhalten von Suspensionen dieser Teilchen ist völlig anders als das von 5 - 10 µm Teilchen. Das schlägt sich besonders im Packvorgang nieder, der bei hohen Drücken und hohen Fließgeschwindigkeiten erfolgt. Das Packen von Trennsäulen in der HPLC erfolgt nach wie vor nach trial und error-Methoden und besitzt keinerlei wissenschaftliche Grundlagen. Alle Versuche, eine Modellierung oder ein tieferes Verständnis dieser komplexen Vorgänge zu erhalten, sind bisher gescheitert. Es ist deshalb von vornherein anzunehmen, dass eine reproduzierbare Herstellung solcher Säulen (vor allem bei kleineren Innendurchmessern) schwierig ist und die Produkte mit großen Schwankungen bezüglich ihrer Eigenschaften behaftet sind.

Der zweite Aspekt betrifft das Arbeiten mit diesen Säulen in der HPLC bei hohen Drücken. Durch die hohen Scherkräfte beim Durchfluß treten Gradienten in der Säulentemperatur, Viskosität des Fließmittels und im Säulendruck auf. In anderen Worten ein isothermes und adiabatische Arbeiten bei der Analyse ist nicht möglich. Dies kann in Abhängigkeit von den genannten Parametern zu Änderungen des Stofftransports und zu Änderungen der Selektivität kommen.
Wo liegen die Vor- und Nachteile von Säulen mit vollporösen Teilchen, mit unporösen Teilchen und einer porösen Schicht und monolithische Trennsäule?

Da beim Arbeiten mit sub-2µm Partikeln bei hohen Gegendrücken eine erhebliche Wärmeentwicklung stattfindet, ist es unabdingbar, diese Wärme abzuführen. Damit dies möglich ist, sollten lediglich Trennsäulen mit kleinen Innendurchmessern
(≤ 2mm) verwendet werden. Da diese Trennsäulen nur eine Länge von 50 - 100 mm haben, beträgt ihr Volumen nur wenige 100 µl. Ferner ist die Bandenverbreiterung dieser Säulen sehr gering. Um diese zu gewährleisten, werden erhebliche Anforderungen an die Gerätekonfiguration gestellt: zum einen müssen alle Zuleitungen und Verbindungen an den UHPLC - Apparaturen mit möglichst kleinen Volumina ausgestattet sein, zum anderen muss die Stärke der Lösemittel, in denen die Proben gelöst sind, schwächer sein als die des Elutionsmittels. Ist dies nicht möglich, kann man UHPLC als Methode nicht verwenden. Wenn die Voraussetzungen gegeben sind, bringt die UHPLC deutliche Vorteile, insbesondere dann, wenn viele Proben mit der gleichen Methode analysiert werden müssen.

Monolithische Trennsäulen haben den Vorteil, dass sie deutlich höhere Volumina haben. Somit sind diese für Proben, die in stärkeren Lösemitteln gelöst sind oder die stärker mit einer Matrix belastet sind, besser geeignet. Der Nachteil hier ist die Drucklimitierung auf 200 bar, was diese Säulen etwas in der maximal erreichbaren Bodenzahl limitiert.

Gerade dieser Nachteil wird von den Säulen mit Core/Shell Materialien aufgewogen. Sie haben den Vorteil, dass man mit diesen Trennsäulen sehr hohe Trenneffizienzen bei recht moderaten Gegendrücken erzielen kann. Ein Nachteil dieser Trennsäulen ist jedoch die etwas geringere Beladbarkeit gegenüber konventionellen, vollporösen Packungsmaterialien.

Der HPLC Säulenmarkt: Erwartungen für die Zukunft
Wo liegen neue Wege zur signifikanten Erhöhung der Selektivität von Trennsäulen.
Die Herstellung eines selektiven Adsorbens, z. B. eines n-octadecylmodifizierten Kieselgels erfolgt nach einer reproduzierbaren Vorschrift, die ein bestimmtes Säulenmaterial mit einer bestimmten Selektivität für einzelne oder Gruppen von Analyten generiert. In anderen Worten, die ermittelte Selektivität einer Trennsäule hängt von Dutzenden von Material- und Verfahrensparametern während der Synthese des Adsorbens und der Fertigung der Säule ab. Wenn diese Verfahren nicht validiert sind und ihre Bedingungen nicht hinreichend genau eingehalten werden, schwanken die Eigenschaften der Säulen beträchtlich. Die Trennsäule ist ein High Tech Produkt und nicht „eine Röhre, die mit Schlamm gefüllt ist".

Wenn man kritisch die Verfahren der chemischen Modifizierung von Oberflächen im Hinblick auf ihr Potential zur Erkennung von Substanzen in der HPLC evaluiert, wird klar, dass noch ein riesiges, nur z. T. genutztes Forschungspotential vor uns liegt. Das liegt auch vor allem daran, dass es sich hier um ein höchst interdisziplinäres Forschungsgebiet handelt, dass die Materialwissenschaften (Synthese und Charakterisierung); Ingenieurwissenschaften (Massentransport, Materialeigenschaften) physikalische Chemie (Interaktionen) und viele andere Fachgebiete umfasst, wobei der Anwender nur das letzte Glied der Kette ist.

Entscheidend ist es, nicht eine Vielzahl von sogenannten chemisch gebundenen Phasen zu generieren, sondern eine begrenzte Anzahl, deren Interaktionen verstanden werden und die auf diesen Kenntnissen aufbauend, maßgeschneidert sind und reproduzierbar hergestellt werden können. Hierzu gehören auch insbesondere die mixed mode Phasen, die je nach Fließmittelzusammensetzung eine äußerst unterschiedliche Selektivität besitzen.

Je komplexer die Synthese ist, umso schwieriger wird es, den Reproduzierbarkeits- oder besser Robustheitsanforderungen, die an die moderne Analytik durch Regulierungsbehörden gestellt werden, nachzukommen. Es macht einen großen Unterschied, ob ein Trennproblem gelöst werden muss, um eine Fragestellung im nicht regulierten Umfeld zu beantworten, oder ob eine Analysenmethode so validiert werden muss, dass diese in jedem Analysenlabor der Erde genauso funktioniert. Während im ersten Fall eine komplexe Lösung mit allen im Analysenlabor zur Verfügung stehenden Geräten, u. a. Detektoren genutzt werden kann, ist es im zweiten Fall fraglich, ob (U)HPLC-Pumpen mit Drücken über 60 MPa und Spezialdetektoren überhaupt in Betracht gezogen werden können. Auch ist bereits die Verwendung von komplexeren, steilen, gegebenenfalls mehrstufigen Gradientenprofilen kritisch. Auch die Verwendung von mixed mode Säulen ist in diesem Zusammenhang schwieriger. Bei Validierungen kommt es primär darauf an, die Methode robust und somit so einfach wie möglich zu gestalten So kommt es häufig vor, dass wissenschaftlich weniger attraktive Lösungen zugunsten von solchen mit mehr Robustheit bevorzugt werden.

Was können wir von der mehrdimensionalen HPLC erwarten?
Wenn man von Peptiden und Proteinen absieht, stellt die mehrdimensionale HPLC für einfache, aber auch komplexe niedermolekulare Stoffgemische ein sehr effektives Mittel zur Erhöhung der Selektivität dar. Die Kopplung von Säulen erfordert allerdings Kenntnisse über das Verhalten der Einzelsäulen und bestimmter Kriterien wie Säulenbeladbarkeit sowie Grundkenntnisse über die apparativen Anforderungen.

Heute sind allerdings Gerätekonfigurationen auf dem Markt, mit deren Hilfe sich mehrdimensionale Trennungen einfach und robust durchführen lassen. Auch hier gilt das Prinzip, ein möglichst einfaches Trennsystem zu installieren.

Durch die Weiterentwicklung der Detektoren, die in der Lage sind, immer empfindlicher Verbindungen nachzuweisen, werden die Trennprobleme zunehmend komplexer. Nicht selten muss aus einer Mischung von mehreren 100 Verbindungen ein bestimmter Analyt bestimmt werden und das auch noch im niedrigen Konzentrationsbereich, während andere Komponenten der Probe in deutlich höheren Konzentrationsbereichen vorliegen. Solche Fragestellungen lassen sich meist nur durch mehrdimensionale HPLC lösen. In der ersten Dimension wird der Elutionsbereich des interessierenden Analyten in eine zweite, für diesen Analyten deutlich selektivere Trenndimension, überführt. Dort kann dann die deutlich weniger komplexe Trennung erfolgen.

Möchte man jedoch die komplette Probe in all ihrer Komplexizität erfassen ist es notwendig, die sogenannte allumfassende multidimensionale HPLC (engl. comprehensive HPLC) zu verwenden. Dies ist dann etwas schwieriger, nicht zuletzt, weil nun die zweite Dimension eine deutlich höhere Geschwindigkeit aufweisen muss, als die erste. Zudem kommt es hier häufig vor, dass eine Komponente nicht nur in einer sondern in mehreren chromatographischen Läufen der zweiten Dimension von der Trennsäule eluiert wird, was einen erheblichen Einfluss auf die Präzision des quantitativen Ergebnisses mit sich bringt.

Trotz all dieser Schwierigkeiten ist es notwendig, an multidimensionalen Systemen weiterhin zu arbeiten. Insbesondere für die zweite Dimension werden auch die neueren Entwicklungen der (U)HPLC-Trennsäulen benötigt, da ohne Säulen mit sub-2µm Materialien die erforderliche Geschwindigkeit gar nicht erreicht werden kann. Somit haben auch die modernen Geräteentwicklungen Einfluss auf die Trennsäulenentwicklung.

Empfehlungen für die Anwender
In den letzten Jahren wurden die Säulen vornehmlich bezüglich ihrer Trenneffizienz (theoretische Bodenhöhe, Bodenzahl) beurteilt. Abgesehen davon, daß das Konzept der Höhe eines theoretischen Bodens (engl. height equivalent of a theoretical plate, HETP) aus der Destillation übernommen wurde und für die HPLC aus verschiedenen Gründen nicht gültig und anwendbar ist, sind die Bodenhöhe bzw. Bodenzahl eine für einen bestimmten Analyten und ein bestimmtes Trennsystem spezifische Größen, die auch von der Gerätekonfiguration und den Operationsbedingungen beeinflusst werden und deshalb mit Vorbehalt betrachtet werden müssen. Weiterhin werden die Werte oft für eine Säule und an einem Gerät von einem Operateur ermittelt und nicht etwa, wie eigentlich erforderlich, in Ringversuchen mit verschiedenen Geräten und Testpersonen. Bei solchen Ringversuchen liegen die relativen Standardabweichungen der genannten Parameter um ein Vielfaches höher als im ersteren Falle. Die Frage stellt sich damit nach dem Wert bzw. Aussagekraft solcher Angaben.

Entscheidend für eine Säulenqualität ist die Reproduzierbarkeit und Robustheit einer Säule bezogen auf die Selektivität. Wenn diese nicht gegeben ist, nützt dem Anwender die höchste Trenneffizienz nichts. Letztendlich entscheidend sind der Transfer einer Analysenmethode auf eine andere und ihre Wiederholbarkeit sowie die Validierung.

Man sollte für jedes Trennproblem eine Liste von Kriterien nach ihrer Priorität aufstellen. Alles andere ist Schönfärberei und geht an der Realität vorbei.

In der HPLC kommt es in erster Linie auf die Selektivität an. Von daher sollte der Anwender darauf achten, ein möglichst breites Portofolio unterschiedlich selektiver Trennsäulen parat zu haben, und auch bei der Methodenentwicklung in Experimenten zu überprüfen. Diese Trennsäulen sollten sich in ihrer Selektivität grundlegend unterscheiden, das bedeutet, dass neben klassischen Umkehrphasen mit Endcapping, auch Umkehrphasen mit einer Selektivität bezüglich Molekülgestalt, Phenyl-Hexyl-Phasen, fluorierte stationäre Phasen und Umkehrphasen mit stickstoffhaltigen polaren funktionellen Gruppen dazugehören. Die wichtigste Grundlage zur Entscheidung, welche Trennsäule die vielversprechendste für das jeweilige Trennproblem ist, hängt vor allem von der analytischen Fragestellung ab. Ist der abzutrennende Analyt bekannt, sind die Wechselwirkungen zwischen stationärer Phase und Analyt für die Trennung ausschlaggebend. Diese gilt es dann maximal für die Trennung zu nutzen.

Jedoch ist es nicht einfach sich im Dickicht von weit über 1.000 unterschiedlichen HPLC-Säulen zurechtzufinden. In dieser Zahl sind noch nicht einmal die Trennsäulen mit unterschiedlichen Korngrößen und Porengrößen enthalten. Es gibt jedoch inzwischen Datenbanken, die bei der Auswahl möglichst unterschiedlicher Trennsäulen behilflich sind.

Hier ein einfaches und vom Hersteller unabhängiges Werkzeug zur Auswahl der idealen Trennsäule für ein entsprechendes Trennproblem zu entwickeln, wird uns noch eine Weile in der Zukunft beschäftigen.

Da Produkte auf der Basis nachwachsender Rohstoffe zu-nehmend an Bedeutung gewinnen, und diese häufig aus polaren Verbindungen bestehen, ist die Trennung dieser Substanzklassen eine weitere Fragestellung, die uns in der Zukunft beschäftigen wird. Manchmal sind diese Analyten so polar, dass sie in der Umkehrphasen HPLC nicht mehr retardiert werden können. Hier hilft unter anderem es ein wässriges Normalphasensystem, auch HILIC (engl. Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) genannt. Solche Trennungen sind wesentlich komplexer, u. a. verdoppeln sich doch die Equilibrierungszeiten. Alternativ dazu ist daher auch immer eine Ionenaustauschchromatographie auf mixed mode Ionenaustauschern (RP/IEX) in Betracht zu ziehen, die immer häufiger Anwendung findet.

Kontakt
Klaus K. Unger
Seeheim-Jugenheim
www.klaus-unger-web.de

Stefan Lamotte
BASF
Ludwigshafen
www.basf.com

Beitrag Coreshell oder Sub 2µ: www.git-labor.de/forschung/chemie-physik/hplc-chromatographiesaeulen
Chemgapedia-Lerneinheit(en) zum Thema: www.chemgapedia.de

Stefan Lamotte
(geb. 1967) studierte Chemie an der Universität des Saarlandes in Saarbrücken und promovierte 1998 bei Prof. H. Engelhardt. 1998 - 2010 war er Leiter des Bereiches Säulen und stationäre Phasen bei der Bischoff Analysentechnik und -geräte GmbH, Leonberg. Seit 2011 ist er Laborteamleiter im Kompetenzzentrum Analytik der BASF SE , Ludwigshafen und seit 2012 Mitglied der Expertengruppe für chromatographische Trenntechniken der Europäischen Arzneibuchbehörde (EDQM) , Straßburg. Seine Forschungsschwerpunkte sind die Entwicklung und Anwendung von flüssig-chromatographischen Methoden.

Klaus K. Unger
(geb. 1936) studierte Chemie an der Technischen Universität Darmstadt (TUD) und promovierte 1965 bei Prof. H. W. Kohlschütter am Zintl-institut der TUD, Habilitation (TUD) 1969. 1977 - 2001 war er Professor für Chemie an der Johannes Gutenberg-Universität, Mainz und von 2001 - 2009 Leiter einer Forschungsgruppe bei der Merck KGaA , Darmstadt. Seine Forschungsschwerpunkte sind das Design und die Synthese poröser Materialien (Adsorbentien und Katalysatoren), ihre Oberflächenfunktionalisierung und Charakterisierung, Entwicklung von Flüssigphasentrennmethoden.

 

Autor(en)

Kontaktieren

BASF AG
Carl-Bosch-Straße 38
67056 Ludwigshafen
Germany
Telefon: +49 621 60 0

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.