Chromatographie und Ihre Arbeitspferde

Dynamisch und kraftvoll mit Quadrupol- und Ion Trap MS

  • Arbeitspferde für die ChromatographieArbeitspferde für die Chromatographie
  • Arbeitspferde für die Chromatographie
  • Abb. 1 : Ein typischer Quadrupol-Filter aus den Anfangstagen der GC-MS
  • Abb. 2: Massenauflösung an einem hyperbolischen Quadrupol von Einheitsmassenauflösung (oben) zu erhöhten Auflösungseinstellungen. Links im Bild die erzielte Peakintensität mit einem deutlichen Einbruch unterhalb der 0.1 Da Einstellung
  • Abb. 3: Single-Quadrupol- vs. Triple-Quadrupol-MS
  • Dr. Hans-Joachim Hübschmann

Chromatographie im Blickpunkt, insbesondere GC-MS und LC-MS:
„Wir nannten es von Anfang an ein „Arbeitspferd". Das ist es wirklich, bis zum heutigen Tag, und darüber hinaus viel mehr. Mit Vorzügen in Scan-Geschwindigkeit, Empfindlichkeit, einfacher Bedienung, einem linearen Signal, und seinem Leistunsvermögen setzte es sich schnell durch." (Bob Finnigan, 2001)

Ideal ergänzt wird das Arbeitspferd Quadrupol durch die Kopplung an die GC. Mit dem chinesischen Neujahrsfest 2014 hat das ‚Jahr des Pferdes‘ Einzug gehalten. Ein guter Zeitpunkt, um ein näheren Bick auf die Arbeitspferde im chromatographischen Labor zu werfen, speziell auf GC-MS und LC-MS. Quadrupol-Massenspektrometer sind unzweifelhaft die modernen Arbeitspferde im Labor, wenn es um Spurenanalyse oder Qualitätskontrolle, qualitative oder quantitative, organische oder anorganische Analytik geht.

Was hat die Quadrupol-Systeme so erfolgreich gemacht? In diesem Essay schauen wir zurück auf den frühen Start, dem Aufkommen des Quadrupol-Massenspektrometers als analytisches Werkzeug für die Chromatographie, beleuchten näher seine einzigartigen und überzeugenden Vorteile im praktischen Einsatz. Und natürlich schauen wir auf den aktuellen Entwicklungsstand mit besonders aktuellen Beispielen.

Kann man atomare Partikel in einem Käfig ohne materielle Wände speichern? Diese Fragestellung ist schon recht alt. So schrieb der Göttinger Physiker Lichtenberg Ende des 18. Jahrhunderts in sein Sudelbuch: „Mich dünkt, es ist ein trauriger Umstand bei unserer ganzen Chemie, daß wir die Bestandteile der Körper nicht frei suspendieren können." Dieser traurige Umstand dauerte bis 1953. Damals gelang es in Bonn, elektrisch geladene Atome, also Ionen, und Elektronen mit Hilfe hochfrequenter elektrischer Felder, der sogenannter Multipolfelder, frei im Raum elastisch aufzuhängen. Wir nannten eine solche Anordnung „Ionenkäfig" (Prof. Wolfgang Paul (1913 - 1993) in einem Vortrag beim Kölner Lindenthal Institut 1991) (1).

Ein neues Massenspektrometer ohne Magnetfeld
Die Forschungsgruppe von Prof. Wolfgang Paul an der Universität Bonn arbeitete in den 1950er Jahren an der spektroskopischen Analyse von Ionen.

Es stellte sich die Frage, wie man Ionen ansammeln und zur weiteren Untersuchung speichern kann. Die Lösung ist heute, zumindest in der analytischen Branche, als Quistor, Quadrupol Ion Storage Device, wohl bekannt. Erhard Fischer, Dotorand in Paul's Arbeitsgruppe, hat 1955 den ersten funktionierenden Ionenkäfig gebaut (2). Ein mechanisches Modell der „Paul Falle" kann heute im Deutschen Museum in Bonn besichtigt werden. Während der Ionenkäfig ein dreidimensionales Gerät ist, kann der Quadrupol mit seinen vier Stäben als eine zweidimensionale Sonderform des Quistor angesehen werden und baut auf den gleichen theoretischen Funktionsprinzipien auf. Es hat bis 1989 gedauert, diese grundlegenden Entwicklungen für die heutigen analytischen „Arbeitspferde" mit dem Nobelpreis für Physik an Prof. Wolfgang Paul, zusammen mit Hans Dehmelt und Norman Ramsay aus Seattle, USA, zu würdigen.

Es war bekanntermaßen der Quadrupol-Analysator, der sich sehr früh mit einer kommerziellen Verwendung als scannendes Massenspektrometer durchgesetzt hat (3). In USA starteten entsprechende Entwicklungen bereits 1960 am Stanford Research Institute für Projekte in der Prozesskontrolle unter Mitwirkung von Robert E. (Bob) Finnigan als leitender Ingenieur. Bob Finnigan wechselte zu Electronic Associates Incorporated (EAI), um den Bereich Prozess-Systeme aufzubauen. Erste erfolgreiche Quadrupol-Anwendungen waren die Analyse von Restgasen (residual gas analysis, RGA), mit einem eng begrenzten Massenbereich, aber einem Scan zur Aufnahme von Massenspektren, der EAI Quad 150 Restgas-Analysator. Zu dieser Zeit war der RGA-Markt von Sektorfeldgeräten mit einem einfachfokussierenden Magnet als Analysator dominiert. Hiermit konnten nur Ionen von zuvor festgelegter Masse mittels Faraday-Cups detektiert werden (dem heutigen SIM vergleichbar). Ein Massenscan war nicht vorgesehen.

Parallel entwickelte sich die Gas-Chromatographie (GC) als Trennverfahren mit hohem Potential für die organische Analytik, in der Prozesskontrolle, der aufkommenden Halbleiterindustrie und natürlich der Petrochemie. Es dauerte nicht lange bis die Idee zur Verbindung der beiden Techniken GC und MS realisiert wurde. Rüdiger Gohlke von Dow Chemical realisierte die erste GC-MS-Kopplung mit einem Bendix Time-of-Flight-Gerät schon 1955 mit einem Spliteinlaß für gepackte Säulen (4, 5). Die Fähigkeit für einen schnellen Massenscan mit 2000 Spektren/s und die gute Spektrenqualität kompatibel zu den gängigen magnetischen Sektorfeld Massenspektrometer setzten bereits hier die Erwartungen in die GC-MS Kopplungstechnik. LKB in Stockholm, Sweden, stellte 1966 das Modell 9000 vor, ein großes magnetisches Sektorfeldgerät speziell vorbereitet für die GC-MS-Kopplung. Gohlke trat 1968 in die Finnigan Corp. ein und betreute hier die Entwicklung der 3000er GC-MS Serie, die damals nicht als Massenspektrometer, sondern speziell als "GC Peak Identifier" angeboten wurde.

Es war die Hewlett-Packard Company (HP), die eines der weiterentwickelten Quadrupol-Massenspektrometer, das Quad 300, bei EAI in Auftrag gegeben hat, nachdem man gerade die F&M Scientific Corporation, ein Gas-Chromatographie Unternehmen gekauft hat."Bill Hewlett and Dave Packard, about the approach we were taking with the quadrupole, recognized that it was a better approach for what they wanted to do at HP than the magnetic MS" berichtete Bob Finnigan in einem späteren Interview (6). Die Nachfrage nach Quadrupol-Geräte stieg in diesen Jahren ständig, nicht nur durch vermehrten petrochemischen Bedarf, sondern auch im Forschungsbereich, z.B. vorangetrieben von Carl Djerassi für die bekannten Arbeiten in der Steroidforschung. Im Jahre 1967 trennte sich Bob Finnigan von EAI, nachdem sein Vorhaben den GC-MS Markt zu entwickeln keine Unterstützung fand. Im selben Jahr gründete er die Finnigan Corporation.

Ein schwieriger Start in die GC-MS
Das Finnigan Modell 1015, vorgestellt 1967, war das erste Quadrupol-Massenspektrometer für die organische Routineanalytik im Labor. Als GC konnte das Gerät wahlweise mit einem Varian Aerograph oder Hewlett Packard Modell ausgestattet werden. Die Kopplung des GCs mit gepackten Säulen wurde mit Hilfe eines Glas-Jetseparators ermöglicht (7). Die U.S. Environmental Protection Agency (US EPA) führte das Modell 1015 als Standard GC-MS für die Kontrolle der „Priority Pollutants" ein. Zu diesem Zeitpunkt konkurrierte die neue Quadrupol-Technik mit Time-of-Flight (ToF) and den magnetischen Sektorfeld-Massenspektrometern. Die anfänglich spärliche Spektrenqualität der ersten Quadrupolgeräte im Vergleich zu Sektorfeldgeräten ist heute vergessen, und durch viele technische Entwicklungen nahezu kompensiert worden. Die geringe Beschleunigung und daduch längeren Flugzeiten zum Detektor ermöglichen metastabilen Ionen den Zerfall vor einer Detektion, ein Effekt der unter Umständen auch heute noch bei der Intensität der Molekülionen von langkettigen Kohlenwasserstoffen zu beobachten ist.

Kommerzielle Massenspektren-Bibliotheken enthalten heute Spektren von verschiedenen Typen von MS-Analysatoren. In der Regel ist die Herkunft der Spektren z.B. in der weithin genutzten NIST-Biobliothek belegt (8, 9). Die Suchalgorithmen wurden über die Jahre hin auch auf die typischen Merkmale unterschiedlicher Analysatortypen hin optimiert und sind tolerant gegenüber Messbedingungen (tuning) und unterschiedlicher Spektrenextraktion aus den Daten (skewing). Heute liefern Quadrupol-Geräte die Mehrzahl der Massenspektren, mehr als von allen anderen Massenspektrometer-Typen.

Vorteile für die Analytik
Die herausragenden Vorteile von Quadrupol-Massenspektrometern sind die kompakte Bauweise, die schnellen Scanraten und die hohe Empfindlichkeit für Spurenanalysen. Eine recht kleine Ionenquelle und der kurze Abstand zum Detektor ermöglichen ein Tischgerät, oft schmaler als der zugehörige GC. In der GC-MS sind die Elektronenstoß- (EI) und chemische Ionisierung (CI) Standard, auf der LC-MS Seite die Elektrospray Ionisierung (ESI) mit Optionen für die „atmospheric pressure chemical ionization" (APCI) oder Photo-Ionisation (APPI). Für die Bauweise ist besonders die geringere Anforderung an das Vakuum von Bedeutung, da hierdurch kleinere Turbopumpen eingesetzt werden können. Selbst kleine Öldiffusionspumpen sind dieser Geräteklasse erhalten geblieben, aber durch Einschränkungen für Wartungsarbeiten heute wenig gebräuchlich. Turbomolekular-Pumpen sind heute Standard für einen unkomplizierten Betrieb und ermöglichen schnell Wartungarbeiten mit kurzen Ein/Aus-Zyklen. Die mechanische Einfachheit ermöglicht auch einen günstigen Kostenrahmen, was natürlich erheblich zur weiten Verbreitung der Quadrupol-Geräte beigetragen hat.

Auf der analytische Seite liefert die Kopplung mit chromatograpischen Verfahren die überzeugendsten Vorteile. Von Anfang an war die hohe Scangeschwindigkeit von Quadrupolen ausschlaggebend für den Einsatz als universeller und gleichzeitig spezifischer Detektor für die Chromatographie. Mit heutigen Scaraten von bis zu 20 000 Da/s sind Quadrupole selbst für ultra-fast GC, UPLC und die mehrdimensionale GCxGC Anwendungen sehr gut geeignet.

Wie funktioniert der Quadrupol-Analysator?
Der Quadrupol besteht aus vier parallelen Elektrodenstäben von bestimmter Länge. Die jeweils gegenüberliegenden Stäbe sind elektrisch miteinander verbunden. Die Filtereigenschaften können beeinflußt werden durch die angelegten Spannungen mit einer Kombination aus einer Wechselspannung mit hoher Frequenz (radio frequency, RF) und einer Gleichstromkomponente (direct current, DC) mit entgegengerichter Polarität zu den Stäben. Ionen, die von der Ionenquelle kommend, axial durch den Filter fliegen, werden auf Basis ihres Masse-zu-Ladung-Verhältnisses (m/z) in ihrer Flugbahn beeinflusst. Nur die Ionen eines bestimmten m/z-Wertes, die eine stabile Flugbahn über die gesamte Länge des Quadrupols aufweisen, können am Ende detetiert werden. In einem Massenscan werden die angelegten Spannungen kontinuierlich so verändert, daß stets höhere Massen (m/z-Werte) stabile Flugbahnen erhalten, und so in einem Durchlauf (scan) ein Massenspektrum registriert werden kann. Ionen ohne stabile Flugbahn werden ausgesondert und durch Auftreffen auf die Stäbe entladen, können also nicht detektiert werden.

Die meisten Quadrupole werden heute aus gutem Grund aus runden Stäben gefertigt, denn so kann preiswert die besten Präzisionen erreicht werden. Denison hat bereits 1971 gezeigt, daß die beste Annäherung an die hyperbolischen inneren Feldlinien beim Einsatz von runden Stäben erreicht werden kann, wenn das Verhältnis des Radius der Stäbe zum Feldradius des Quadrupols einen Wert von 1,148 hat (10). In der heutigen Praxis führt es dazu, daß eine weite Eintrittsöffnung und Stäbe mit größeren Durchmessern verwendet werden, um hohe Empfindlichkeiten zu erhalten. Quadrupol-Stäbe mit hyperbolischem Querschnitt entsprechen in idealer Weise den inneren Feldlinien, und liefern zusätzliche analytische Vorteile bei der Massentrennung, falls die mechanische Präzision von besonders hoher Güte ist.

Einstellbare Massenauflösung
Ein weiterer großer Vorteil beim Einsatz von Quadrupolen war von Anfang an die leicht einstellbare Massenauflösung. Eine Hochauflösung, wie diese von Sektorfeldgeräten, ToF-, oder Orbitrap-Analysatoren bekannt ist, kann jedoch nicht erreicht werden. Es sind keine technisch aufwendigen Spaltsysteme wie bei den damals konkurrierenden Sektorfeldgeräten erforderlich. Die Massenauflösung wird rein elektrisch durch das Verhältnis der angelegten Gleich- und Wechselspannung (RF/DC) bestimmt. Der Massenscan wird durch eine steigende Rampe der Spannungen bei konstantem RF/DC-Verhältnis erreicht. Eine anschauliche Vereinfachung wird durch die bekannten Stabilitätsdiagramme gegeben (11).

Typisch für Quadrupole ist, dass die Breite der Massensignale über den gesamten Massenbereich konstant ist. Die Massenpeaks bei Quadrupolen sind keine Gauss-förmigen Peaks, sondern weisen in einem idealen Quadrupol steile Flanken mit einem mehr oder weniger stark ausgeprägten Plateau auf. Die werkseitige Einstellung ist auf die Nominalmassentrennung eingestellt (unit mass resolution, Einheitsmassen-Auflösung). Ganzahlige Massen (m/z Werte) können gut voneinander getrennt werden. Die Breite der Massenpeaks beträgt dann in der Regel 0.7 Da bei halber Höhe (full width half maximum, FWHM). Die auf dem Bildschirm ausgelesene Massenzahl wird aus dem Massenschwerpunkt des Signals berechnet, und kann sehr präzise berechnet werden, in der Regel werden zwei Kommastellen angegeben. Diese Massenzahl gibt jedoch keinen Hinweis durch die angezeigten Nachkommastellen auf eine entsprechend feine Massenauflösung wie diese von hochauflösenden Massenspektrometern bekannt ist.

Die Auflösung des Analysators bestimmt die Selektivität und Empfindlichkeit (Transmission) des Analysators. Eine höhere Massenauflösung geht mit erhöhter Selektivität einher, reduziert jedoch die Transmission und damit die Nachweisempfindlichkeit. Mit runden Stäben können heute verbesserte Auflösungen von bis zu 0.4 Da erzielt werden, um eine verbesserte Selektivität für Targetverbindungen in stark matrixhaltigen Proben zu erreichen. Insbesondere wird diese Eigenschaft bei Triple-Quadrupol-Geräten ausgenutzt, um die Auflösung entsprechend den analytischen Anforderungen mit „narrow" (0.7 Da), „normal" (1.5 Da) oder „wide" (2.5 Da) einstellen zu können, siehe Abb.2.

Empfindlichkeit
Sieht man einmal von der Ionenquelle ab, ist die Empfindlichkeit bei einer vorgegebenen Auflösungseinstellung in erster Linie von der Messzeit pro Ion abhängig (dwell time). Dies ist die Zeit, die ein Ion ausgewählter Masse am Detektor registriert wird. Bei der Aufnahme kompletter Massenspektren (full scan) ist die Messzeit sehr limitiert, um in kurzer Zeit von wenigen 100 ms ein komplettes Spektrum über den gesamten Massenbereicht erfassen zu können. Schnelle Chromatographie mit schneller Abtastrate verringert weiter die Empfindlichkeit im full scan-Betrieb. Der full scan-Modus ist deshalb gut für qualitative Arbeiten, wie das Anlegen und Erweitern eigener Spektrenbibliotheken oder der Identifizierung von Unbekannten, geeignet.

Für Quantifizierungen wird in der Regel der SIM-Modus eingesetzt (selected ion monitoring, auch multiple on detection, MID). Die Messzeit pro Ion erhöht sich erheblich, weil die durch die Abtastrate vorgegebene Zykluszeit nur wenigen charakteristischen Ionen zugeordnet wird, es steht jedoch kein Spektrum der Verbindung mehr zur Verfügung. Bei der Nutzung des SIM-Modus ist es deshalb ratsam, und in vielen offiziellen Methoden gefordert, mindestens zwei spezifische Ionen zu erfassen, um über das Intensitätsverhältnis eine zusätzliche Bestätigung zu erhalten. Sphon schlägt schon 1978 vor, besser drei Signale pro Komponente zu erfassen, was dann drei relative Intensitäten, statt nur einem Verhältnis zur Überprüfung zulässt (12). In der EU sind die Anforderungen für den Einsatz des SIM-Modus im „identification-point"-System zur Identifizierung von nicht erlaubten und limitierten organischen Rückständen und Kontaminanten in Lebensmitteln geregelt (13).

Welche Vorteile bieten Ionenfallen?
Ionenfallen-Analysatoren (ion traps) sind die engen dreidimensionalen Verwandten des Quadrupols. Speziell bei der Verlängerung der Messzeit pro Ion können sie sehr hilfreich sein. Der Ionenfallen-Analysator besteht aus drei Komponenten und arbeitet nach den gleichen physikalischen Grundprinzipien und einer Ansteuerung mit Hochfrequenz- und Gleichspannungen wie der Quadrupol. Zwei Endkappen und ein Ring, alle mit hyperbolischen Querschnitten, definieren einen Raum zum Speichern von Ionen, der ursprünglichen Zielsetzung von Prof. Pauls Arbeitsgruppe. Es war George Stafford bei Finnigan, der aus dem ursprünglichen Ionenspeicher Quistor einen scannenden Analysator zur Aufnahme von Massenspektren entwickelte (14).

Bei Ionenfallen-Geräten können die Ionen innerhalb der Falle selbst, oder aber wie bei Quadrupolgeräten in einer separaten Ionenquelle erzeugt werden, was heute die gebräuchliche Anordnung ist, um eine kompatible Spektrenqualität zu gewährleisten. Die Stärke des Ionenfallen-Analysators ist seine Fähigkeit die gebildeten Ionen zunächst anzusammeln und dann nach Masse sortiert (m/z) das Spektrum auf den Detektor zu schicken. Die Fähigkeit zur Ionenspeicherung bietet zwei signfikante Vorteile, bei denen Quadrupole systembedingt Limitierungen aufweisen. Schwache Ionenstrahlen können „integriert" werden und ein Massenspektrum kann registriert werden, wenn der Quadrupol als Ionenstrahlgerät bereits in den SIM-Modus übergehen muss, um genügend Messzeit für nur wenige Ionen bereitzustellen. Hierdurch wird die Bestätigung von Positivbefunden über das Spektrum möglich, was unter anderem in der Bestätigung von positiven Steroid-Dopingbefunden eingesetzt wird. Besonders bei LC-MS Anwendungen kommt, in Verbindung mit dem MS/MS-Modu,s auch dieser Vorteil zum Tragen. Die Möglichkeit MS/MS-Verfahren bei Ionenfallen einzusetzen ist ein weiterer unschätzbarer Vorteil in dieser Geräteklasse.

Analysen im MS/MS-Modus
Die in der Ionenfalle gespeicherten Ionen können auf mehrfache Weise durch die Ansteuerung des Analysators beeinflußt werden. Für den MS/MS-Modus wird zunächst das Vorläufer-Ion ausgewählt, und die übrigen Ionen aus dem Speicher entfernt. Eine Anregung des Vorläufer-Ions führt zur Fragmentierung der Struktur (collision-induced fragmentation, CID) und liefert Produkt-Ionen, die während des Vorgangs gespeichert bleiben. Der CID-Prozesses im Ionenfallen-Analysator liefert eine höhere Ausbeute an Produkt-Ionen und somit eine höhere MS/MS-Effizienz als das von Quadrupol-Systemen bekannt ist (15). Die MS/MS-Massenspektren der Ionenfalle sind im Vergleich zu Quadrupolen reich an Fragmenten und ermöglichen auch bei geringen Analyt-Konzentrationen eine gute Möglichkeit zur selektiven Quantifizierung. Die hohe Empfindlichkeit in der LC-MS mit ESI-Ionisierung (electrospray ionization) hat den Ionenfallen-Analysators zum idealen Gerät für die Analytik von polaren Pestiziden gemacht. Die Target-Quantifizierung kann hier mit der Identifizierung von unbekannten Kontaminaten verbunden werden.

In gleicher Weise erlaubt die Ion Trap-MS die Verwendung mehrerer aufeinander folgender MS/MS-Stufen für die Strukturaufklärung. Dies ist insbesondere in der LC-MS von Bedeutung, da die weiche Ionsierung zunächst intensive Molekülionen liefert, die in den nachfolgenden MS/MS-Schritten fragmentiert werden können. Technisch gesehen sind die MS/MS-Prozesse auf bis zu 10 Stufen begrenzt. Die Auswahl der geeigneten und gewünschten Ionen wird durch eine vom Anwender unabhängige datenabhängige Steuerung während der Datenaufnahme erreicht (data dependent scanning), was die Gestaltung der Methode erheblich vereinfacht. Schließlich wird auf diese Weise ein „Zerfallsbaum" (fragmentation tree) erstellt, der durch geeignete Programme ausgewertet wird. MassFrontier ist hier eine besonders leistungsfähige Software-Lösung, um die in den Spektren enthaltenen Information auszuwerten und zu einem Gesamtbild mit dem Vorschlag für eine mögliche Struktur zusammenzuführen (16).

Grenzen der Ionenfallen
Die starken analytischen Vorteile von Ionenfalle gehen außerhalb des optimalen Bereiches mit Einschränkungen einher. Wie alle Speichermedien haben sie ein begrenztes Speicherpotential, das ständig durch eine dynamische Regelung der Integrationszeit kontrolliert wird (automatic gain control, AGC). Hierduch wird ein besonders hoher dynamischer Bereich von mehr als sechs Größenordnungen erzielt. Bei Proben mit einem hohen Matrixgehalt wird die Speicherkapazität zu einem hohen Anteil von den Ionen der Matrix, und anteilig von den Analyten genutzt. Ionenfallen sind also besonders leistungsfähig für Spurenanalyse aus gut aufgereinigten Probenextrakten, Headspace oder SPME-Analysen. Die Lösung für diese Einschränkung bei Matrixproben im full scan-Modus ist die Nutzung der inhärenten MS/MS-Fähigkeit für viele rückstandsanalytische Aufgaben (17).

Ein anderer Aspekt von Ionenfallen steht im Konflikt mit den Erwartungen für eine schnellere Analytik für eine größere Anzahl von Komponenten. Die Ansammlung, Selektion und Fragmentierung von Ionen im MS/MS-Betrieb benötigt Zeit. Die zeitlichen Abläufe werden hier von der Intensität des Ionenstrahls vorgegeben, was in einem Strahlgerät wie dem Quadrupol keinen Einfluß auf die Arbeitsweise hat. Hier sind die Funktionen der MS/MS auf unterschiedliche Komponenten verlagert, die praktisch parallel arbeiten können. Diese prinzipiellen Unterschiede haben zu der bekannten Terminologie „MS/MS in time" bei Ionenfallen und „MS/MS in space" bei Quadrupol-Geräten geführt (18).

Der Durchbruch der Quadrupol-MS/MS-Technik
In den frühen 1980er Jahren entstanden aus der Zusammenarbeit von Prof. Rick Yost an der Florida Universität in Gainesville mit Finnigan die ersten Triple-Quadrupol-Systeme, aus der konsequenten „Verlängerung" der damaligen Single-Quadrupol-Geräte mit einer Stoßzelle, die zwei Quadrupol-Analysatoren verbindet. Seit diesem Zeitpunkt sind Triple-Quadrupol- Massenspektrometer durch ihre MS/MS-Fähigkeit eine wertvolle Ergänzung in der Strukturaufklärung organischer Substanzen.

Die MS/MS-Technik fand eine breite Akzeptanz für die quantitative Routineanalytik parallel zu den steigenden Anforderungen and die Sicherheit von Lebensmitteln und den geforderten niedrigeren Konzentrationen von Verunreinigungen in Wasser und anderen Umweltproben. Unter Anderem sind hier der Codex Alimentarius mit seinen detailierten Regelungen für Pflanzenschutzmittel in Lebensmitteln, sowie die Europäische Wasserrahmenrichtlinie WRRL (European Water Framework Directive, WFD) zu nennen. Hieraus entwicklte sich eine starke Nachfrage nach Multimethoden mit kurzer Probenaufarbeitung, um den internationalen Regelungen in effektiver Weise zu folgen.

Ein gut bekanntes Beispiel ist in diesem Zusammenhang die Entwicklung der Pestizidanalytik in den vergangenen Jahren. Die optimierte substanzklassenspezifische Probenvorbereitung und Analyse wird zunehmend durch Methoden ersetzt, die verschiedene Klassen von Pestiziden von unterschiedlicher chemischer Natur in einem Schritt erfassen können. Neben den Verfahren der Flüssigextraktion (DFG S19, EN 12 393, Luke, mini-Luke) haben sich die Aufarbeitungsverfahren mit dispersiver SPE (QuEChERS, AOAC 2007.01, CEN 15662) international durchgesetzt. Ein weiterer Vorteil ist die Kompatibilität von QuEChERS-Extrakten für GC-MS und LC-MS. Über den Einsatz in der Pestizidanalytik gewinnen diese Verfahren zunehmend Bedeutung auch in der Analytik von POPs, PAHs oder Drogen.

Eine wesentliche Einschränkung und diesen Multimethoden gemein ist der hohe Anteil an Probenmatrix. Der Aufreinigungsprozess ist zu ineffizient, um hohe Wiederfindungen für alle Stoffklassen zu gewährleisten. Die klassichen Detektoren und auch die so erfolgreichen Single-Quadrupol-MS-Geräte kommen hier an die Grenze ihrer Selektivität. Die spezifischen Massen der Analyten sind auch im SIM-Modus häufig durch Matrix überdeckt. Ein Single-Quadrupol- oder ToF-Gerät kann nicht unterscheiden, ob eine Masse durch den Analyten oder die Matrix generiert wurde. Obwohl eine hohe Empfindlichkeit für reine Extrakte vorliegt, ist die reine Massenselektivität nicht ausreichend, um im Spurenbereich die komplexen Extrakte der Multimethoden zu vermessen.

Der Einsatz der Triple-Quadrupol-MS brachte die Lösung für Multimethoden. Das Konzept des MS/MS-Beriebs im Modus des „selected reaction monitoring" (SRM) liefert die benötigte Selektivität und Empfindlichkeit für die Spurenanalyse in den stark matrixhaltigen Extrakten. Durch die schnelle elektrische Ansteuerung der Quadrupole können zielgerichtete analytische Methoden für hunderte von Analyten in einem einzigen Lauf erstellt werden, allgemein als „multiple reaction monitoring"-Methoden (MRM) bezeichnet.

Erstellung von MRM-Methoden
Die Funktion des Triple-Quadrupol-MS für MRM-Methoden kann von einem Single-Quadrupol-Gerät im SIM-Modus abgeleitet werden. Dies erlaubt generell die bekannten SIM-Methoden für eine Triple-Quadrupol-Methode zu erweitern. Der erste Quadrupol (Q1) arbeitet wie bisher im SIM-Modus. Die selektierten Ionen werden aber nicht detektiert, sondern in der sich anschließenden Kollisionszelle fragmentiert. Von allen entstandenen Produkt-Ionen werden im dritten Quadrupol (Q3) nur diejenigen herausgefiltert, die aus der Struktur des Zielanalyten entstanden sind. Die Matrix-Ionen aus Q1 haben zwar die gleiche Masse, jedoch ist ihre Struktur unterschiedlich und führt zu anderen Fragmenten, die in Q3 aussortiert werden. Auf diese Weise wird eine Selektivität eingeführt, die spezifisch für die Struktur des Analyten ist.

Der Aufbau von MRM-Methoden kann sehr zeitraubend sein, weil für jede Verbindung das Vorläufer-und Produkt-Ion, sowie die optimale Kollisionsenergie zu bestimmen ist. Es werden für jede Zielverbindung mindestens zwei SRM-Übergänge ausgewählt. Diese Aufgabe kann für nur wenige Komponenten durch die Vielzahl der nötigen Messungen mehrere Wochen in Anspruch nehmen. Überschlagsmäßig kann man sagen, daß für 50 Verbindungen etwa 2000 Spektren ausgewertet werden müssen. Jede Verbindung wird individuell in einem Standardcocktail mittlerer Konzentration vermessen. Zunächst wird ein komplettes Spektrum im full scan-Modus aufgenommen, die beiden höchsten Intensitäten als mögliche Vorläufer-Ionen notiert und die Retentionszeit bestimmt. In einer weiteren Analyse werden die Spektren der ausgewählten Produkt-Ionen bei einer mittleren Kollisionsenergie aufgezeichnet. Hieraus werden jeweils die intensivsten Ionen notiert. An dieser Stelle sind die beiden erforderlichen SRM-Übergänge für die zu messenden Analyten bekannt. Zur weiteren Optimierung sind in der Regel mehrere Läufe des Standards erforderlich, um für die beste Nachweisempfindlichkeit die optimale Kollisionsenergie zu ermitteln. In der Regel erfolgt das in Schritten von 5 oder 10 V im Bereich bis zu 50 V. Aus den Ergebnissen wird die optimale Einstellung der Kollisionsenergie für jeden SRM-Übergang ermittelt. Damit ist die MRM-Methode komplett.

Zwei unterschiedliche Ansätze versuchen diese zeitraubende Vorbereitung abzukürzen. Eine Möglichkeit sieht die Nutzung von Datenbanken vor, die die SRM-Einstellungen für eine große Anzahl von Analyten für eine bestimmte GC-Säule und Methode beinhalten. Fehlende Analyten müssen manuell nachgetragen werden. Mehr Flexibilität wird duch automatische Abläufe bereitgestellt, die die oben beschriebenen Schritte programmgesteuert duchführen und als Ergebnis die einsatzbereite Analysenmethode liefern (siehe Abb AutoSRM). Auf diese Weise können auch neue Verbindungen in eine eigene Datenbank für zukünftige Verwendungen eingetragen werden.

Die hier aufgeführten Beispiele sollen nicht die Bandbreite der weit verbreiteten Anwendungen der Quadrupol-Technik zeigen. Die Auswahl wurde getroffen, um den aktuellen, hohen Entwicklungsstand der Technik an drei besonderen Beispielen aus der Praxis zu demonstrieren. Weitere aktuelle Beispiele dazu finden Sie über den Crossmediabalken online.

Ausblick
Die Quadrupol-Massenspektrometrie schaut auf eine lange erfolgreiche Geschichte für organische wie anorganische Einsatzbereiche zurück. Es gab bis heute und es wird auch weiterhin Potential für technische Verbesserungen und Innovationen geben. Hier sind höhere Empfindlichkeiten, Robustheit durch Einführung von Matrix-Vorfiltern und eine leichtere Wartung zu nennen, z.B. durch im Betrieb austauschbare Ionenquellen. Der Einsatz der MS/MS-Technik wird durch eine weiter ausgefeilte automatische Methodenerstellung erheblich vereinfacht.

Unzweifelhaft sind und bleiben die Single-Quadrupol-Geräte die Arbeitspferde im chromatographischen Labor. Triple-Quadrupol-Systeme sind aber deutlich auf dem Vormarsch, speziell um den Anforderungen für Multimethoden in gering aufgearbeiteten Extrakten gerecht zu werden. Um die Leistungsfähigkeit der Labore für Routineaufgaben weiter zu steigern werden MS/MS-Systeme eine starke Entwicklung aufweisen.

An dieser Stelle sei ein Ausblick in die nahe Zukunft erlaubt. Die Quadrupol-Technik steht heute auf einem sehr hohen Stand der Technik, es ist eine „reife" Technologie. Fortschritte sind daher eher auf der Seite der Ionisierung mit höherer Ionenausbeute, der Detektortechnologie oder der Signalverarbeitung zu erwarten. Es ist damit ein Zeitpunkt erreicht, zu dem eine neue Technologie einen Sprung wagt, in Anlehnung an die Technologie-Zyklen der Kondratjew-Theorie. Es ist aber nicht die Technologie selbst, die hier einen Wandel bewirkt, sondern die sich wandelnden Aufgaben und Erwartungen, die in der Analytik mit zunehmenden Erkenntnissen stetig steigen.

Erneut sind Pestizide ein gutes Beispiel. Zunächst wurden einzelne Stoffgruppen mit spezieller Aufarbeitung und selektiver Detektion bestimmt. Der aktuelle Stand verlangt nach Multimethoden für Hunderte von Analyten, um die steigende Anzahl von Wirkstoffen effizient erfassen zu können. Offen diskutiert wird dabei die Frage nach den nicht aufgelisteten und möglicherweise bedenklichen Kontaminanten in einer Probe (Lebensmittel, Pharma, Forensik).

Es zeichnet sich bereits jetzt ab, dass über die zielgerichtete Analytik (targeted) hinaus die Erwartungen sich auf zusätzliche unbekannte Kontaminationen (unknowns, non-targeted) hin bewegen, die unter Umständen eine Gefährdung darstellen können. Es kündigen sich hierzu neue Technologien an, die diesen Aufgaben besser gerecht werden können. Hier ist die Bestimmung der akkuraten Masse von Bedeutung, die uns den Zugang zur Summenformel und damit zu einer Identifizierung der Unbekannten führt. Die Quadrupol-Arbeitspferde werden uns sicher über viele Dekaden als Single-Quadrupol- oder mehr noch als Triple-Quadrupol-Geräte zur Target-Quantifizierung erhalten bleiben. Time-of-Flight- (ToF) und Orbitrap-Analysatoren bieten hier jedoch bereits heute die Fähigkeit zu einer Identifizierung über die Summenformel. Insbesondere die rasante Entwicklung und Nutzung der Orbitrap-Technik (19, 20) zeigen, dass sich heute schon ein Technologiesprung ankündigt, der die targeted und non-targeted Analytik für Routineaufgaben zusammenfließen lässt, und die gegebenen Limitierungen der heutigen „Arbeitspferde" überwinden kann.

 

Anwendungsbeispiele und Literaturverzeichnis: http://bit.ly/Huebschmann1
Handbook of GC/MS: http://bit.ly/HandbookGCMS

Lebenslauf
Dr. Hans-Joachim Hübschmann
Promovierte als Lebensmittelchemiker an der Technischen Universität Berlin mit einer Arbeit zur LC/MS-Analytik von anabolen Steroiden und von Pestiziden in der Nahrung. Seine berufliche Karriere in der Industrie begann er mit Anstellungen in Deutschen Unternehmen im Bereich Gaschromatographie und Massenspektrometrie. Im Jahr 2002 kam er zu Thermo-Fisher in Bremen in verschiedenen internationalen Positionen im Bereich anorganische- und isotopen Massenspektrometrie, hochauflösende GC/MS und GC-MS/MS. Er baute zudem das renommierte POPs Center of Excellence in Bremen auf. Heute arbeitet Herr Hübschmann als "Technology Director for GC & GC/MS" (APAC) in Singapur. Bei Wiley ist Herr Hübschmann Autor des „Handbook of GC/MS", dessen 3. Auflage im Oktober 2014 erscheinen wird.

Autor(en)

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Thermo Fisher Scientific
11 Biopolis Way 0
Singapore 138667
Singapore

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