Der Verteilung von Molekülen auf der Spur

Einsatzgebiete und Möglichkeiten der molekularen Kamera

  • Abb. 1: Aufnahmen mit der molekularen Kamera eines coronalen Maushirnschnitts mit 10 µm Pixelauflösung (a) und des einzelligen Organismus Paramecium caudatum (Pantoffeltierchen) mit 2 µm Pixelauflösung (b, d). Zugehörige Mikroskopaufnahmen in (c, e). Die Skala ist 500 µm in a) und 50 µm in b), c), d), e).Abb. 1: Aufnahmen mit der molekularen Kamera eines coronalen Maushirnschnitts mit 10 µm Pixelauflösung (a) und des einzelligen Organismus Paramecium caudatum (Pantoffeltierchen) mit 2 µm Pixelauflösung (b, d). Zugehörige Mikroskopaufnahmen in (c, e). Die Skala ist 500 µm in a) und 50 µm in b), c), d), e).
  • Abb. 1: Aufnahmen mit der molekularen Kamera eines coronalen Maushirnschnitts mit 10 µm Pixelauflösung (a) und des einzelligen Organismus Paramecium caudatum (Pantoffeltierchen) mit 2 µm Pixelauflösung (b, d). Zugehörige Mikroskopaufnahmen in (c, e). Die Skala ist 500 µm in a) und 50 µm in b), c), d), e).
  • Abb. 2: Anwendung der molekularen 3D-Kamera auf einer 1-Euro-Münze und einem Kleeblatt. Mikroskopische Aufnahmen der Münze (a), die Probentopographie in (b) und die molekulare Darstellung der 3D Oberfläche in (c). Mikroskopische Aufnahme eines Kleeblatts (Trifolium repens) in (d), die Probentopographie in (e) und die molekulare Probenoberfläche in (f). Die Skala ist 800 µm in a), b) und 2 mm in d), e), f).

Mit bildgebenden massenspektrometrischen Verfahren lassen sich unzählige Stoffe nachweisen, identifizieren und deren räumliche Verteilung bildlich darstellen. Vorteile von Mikroskopie und Massenspektrometrie werden in diesen Geräten vereint, die somit als molekulare Kamera fungieren. Die hier verwendeten molekulare Kamera erlaubt vor allem in der Biologie, Medizin und Chemie neue Einblicke in die Oberflächenbeschaffenheit komplexer Proben und den molekularen Aufbau von Gewebeschnitten.

Bildliche Darstellung massenspektroskopischer Daten

Moderne Hochleistungsmassenspektrometer erlauben es, die stoffliche Zusammensetzung von komplexen Proben zu analysieren. Daher findet die Massenspektrometrie (MS) als analytisches Werkzeug vor allem in der Chemie, Medizin und Biologie Verwendung. Von der Identifizierung einzelner Bestandteile eines komplexen Stoffgemisches bis zur atomaren Zusammensetzung einer Probe lassen sich eine Vielzahl chemischer Informationen gewinnen. Dazu müssen Probenbestandteile aber zunächst ionisiert werden. Dies kann beispielsweise mit Hilfe der matrix-unterstützten Laser Desorption/Ionisation (MALDI: Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization) erfolgen. MALDI wurde in den 1980er Jahren von Michael Karas und Franz Hillenkamp entwickelt und erlaubt es, Biomoleküle intakt zu desorbieren und zu ionisieren [1]. Der Analyt wird dabei in eine organische Matrix eingebettet. Die Matrix dient vor allem dazu, Laserlicht zu absorbieren, Fragmentierung von Substanzen zu verhindern und den Analyten zu verdampfen und zu ionisieren. Die Analytionen können daraufhin im Massenspektrometer analysiert und anhand ihres Masse-zu-Ladungszahl-Verhältnisses (m/z) identifiziert werden. Mit MALDI war es erstmals möglich, große Biomoleküle mit einer Masse von mehreren tausend Dalton intakt zu desorbieren, zu ionisieren und im Massenspektrometer zu analysieren. In den 1990er Jahren wurde MALDI von Bernhard Spengler zu einer bildgebenden massenspektrometrischen Methode (MSI: Mass Spectrometry Imaging) weiterentwickelt, mit der es nun möglich war, die räumliche Verteilung von Molekülen in einer dünnen Probe darzustellen [2].

Um MALDI-MSI betreiben zu können, muss der Laser fokussiert auf einen kleinen Bereich der Probe gerichtet werden, wodurch räumlich begrenzte Desorption und Ionisierung stattfindet. Durch gezieltes Bewegen der Probe ist es somit möglich, die Probenoberfläche punktuell abzutasten und die im Massenspektrometer erhaltenen chemischen Informationen mit den Ortsinformationen zu verknüpfen. Folglich kann bei MSI jedes Massenspektrum mit einem Bildpunkt (Pixel) in Verbindung gebracht werden. Die Darstellung des Intensitätsverlaufes eines massenspektrometrischen Signals für alle aufgenommenen Pixel ermöglicht somit die Visualisierung der Verteilung der zugrundeliegenden Substanz. Dies ist beispielhaft in Abbildung 2a für einen coronalen Maushirnschnitt für drei Substanzen gezeigt. Dabei sind die Substanzverteilungen rot, grün bzw. blau farbkodiert (RGB Bilder). Es entstehen mikroskopische Bilder, die aber molekulare Information enthalten, und MSI-Geräte können somit als molekulare Kameras angesehen werden.

Einsatz der MSI-Technologie für die Routineanalytik

Trotz des großen Potenzials und schon bestehender Anwendungsbereiche gibt es noch einige Hindernisse, bevor die MSI-Technologie für die breite Routineanalytik genutzt werden kann: 1) Vor allem für Hochdurchsatzanwendungen sind die relativ langen Messzeiten oftmals problematisch. 2) Die Pixelgrößen sind in den meisten MSI-Instrumenten auf >20 µm beschränkt und bieten somit nicht genügend Auflösung für diverse Fragestellungen. 3) Für MSI-Experimente müssen in der Regel flache Proben mit geringen Höhenunterschieden, wie z.B. sehr glatte Gewebeschnitte verwendet werden.

Durch Weiterentwicklungen der molekularen Kameras ist es in den letzten Jahren gelungen, benannte Probleme teilweise oder vollständig zu lösen und somit ein detailliertes Bild von komplexen Oberflächen zu erhalten [3-5].
1) Vor allem für Hochdurchsatzanwendungen, z.B. im klinischen oder pharmakologischen Labor, ist die benötigte Messzeit ein kritischer Faktor. Massenspektrometer mit erhöhten Aufnahmegeschwindigkeiten und kontinuierliches Abtragen/Ionisieren der Oberfläche ermöglichen die Verkürzung des Messvorgangs. So wurde beispielsweise das Bild in Abbildung 1a mit 160.000 Bildpunkten mit der neuen Technik in 8 h aufgenommen, wohingegen ein punktuelles Abtasten derselben Fläche bisher 60h gedauert hätte. Der Zeitaufwand der Messungen konnte somit um den Faktor 7.5 verringert werden. Hochdurchsatzmessungen hochaufgelöster molekularer Bilder rücken nun in den Bereich des Machbaren.

2) Verbesserte MALDI-MSI-Systeme erlauben es seit Kurzem, die Pixelauflösung auf 1 – 2 µm zu reduzieren. Somit können intakte Biomoleküle sogar innerhalb einzelner Zellen sichtbar gemacht werden [6]. In Abbildung 1b und 1d sind molekulare Bilder des einzelligen Organismus Paramecium caudatum mit einer Pixelgröße von 2 µm dargestellt. Erstmals ist es mit dieser Technik möglich, eine molekulare Verteilung von Metaboliten und Lipiden innerhalb einzelner Zellen sichtbar zu machen. Somit könnten in Zukunft beispielsweise krankhafte Veränderungen des Metabolismus oder Mechanismen der Wirkung von Medikamenten auf zellulärer Ebene untersucht werden.

3) Als Folge der gesteigerten räumlichen Auflösung ergibt sich eine deutlich reduzierte Tiefenschärfe der MSI Verfahren, was es unmöglich macht, große Flächen oder unebene Proben gleichmäßig zu untersuchen. Befindet sich bei MALDI die Probe nicht exakt in der Fokusebene des Lasers, kann es zu verminderter oder gänzlich ausbleibender Desorption und Ionisation des Analyten kommen. Ein Darstellung oder Quantifizierung von Substanzen wird dadurch deutlich erschwert oder sogar unmöglich. Neuartige Autofokusverfahren erlauben es hingegen, mit molekularen Kameras große oder unebene Proben und sogar Oberflächen dreidimensionaler Proben abzubilden [7]. So können nicht nur durch die Probentopographie hervorgerufene Messfehler verhindert und der Fokussiervorgang automatisiert werden, sondern es wird gleichzeitig die Oberflächenstruktur vermessen. In Abbildung 2 sind hierzu einige Anwendungen der autofokussierenden molekularen Kamera gezeigt. Anorganische (1-Euro-Münze, Abb. 2a) oder biologische Oberflächen (Kleeblatt, Trifolium repens, Abb. 2d) können ohne topographische Messfehler untersucht werden. Die topographischen Probeninformationen (Abb. 2b,e) werden anschließend mit molekularen Bildern zu molekularen 3D-Bildern vereint (Abb. 2c,f). Beispielsweise Kontakt-oberflächen von Organismen und Gegenständen, Ablagerungen auf Münzen nach Gebrauch oder organismische Abwehrreaktionen bei Parasitenbefall können mit dieser neuen Technologie erstmals auf molekularer Ebene untersucht werden.

Ausblick

Molekulare Kameras erlauben es bei einer Vielzahl analytischer Fragestellungen, Informationen über die Verteilung von Molekülen in oder auf Proben zu liefern. Dabei werden keine chemischen Sonden, wie beispielsweise Fluoreszenz- oder Radionuklidmarker, benötigt. Dank der neuen Entwicklungen der letzten Jahre können molekulare Verteilungsbilder deutlich schneller, mit subzellulärer räumlicher Auflösung und sogar direkt von unebenen Proben aufgenommen werden. Dies eröffnet eine Vielzahl von neuen Forschungs- und Anwendungsfeldern. Autofokussierung und erhöhte Messgeschwindigkeiten der neu entwickelten MSI-Verfahren sollten beispielsweise die Verwendung von molekularen Kameras in klinischen/pharmazeutischen Hochdurchsatzlaboren deutlich vereinfachen. Die Möglichkeit 3D-Oberflächen zu untersuchen, ist vor allem in der Biologie von Interesse: Kontaktoberflächen und somit auch chemische Kommunikation zwischen Mensch, Tier und Pflanzen können nun auf molekularer Ebene und mit subzellulärer Auflösung untersucht werden. Es bleibt daher spannend, in welchen Anwendungsfeldern die molekularen Kameras der nächsten Generation den größten Einfluss erlangen werden.

Autoren
Mario Kompauer1, Sven Heiles1, Bernhard Spengler1

Zugehörigkeit
1 Institut für Anorganische und Analytische Chemie, Justus-Liebig-Universität Gießen, Gießen, Deutschland

Kontakt 
Prof. Dr. Bernhard Spengler

Institut für Anorganische und Analytische Chemie
Justus-Liebig-Universität Gießen
Gießen, Deutschland
Bernhard.Spengler@anorg.chemie.uni-giessen.de

Referenzen
[1] Karas, M.; Hillenkamp, F. Anal. Chem. 1988, 60, 20, 2299–2301, DOI: 10.1021/ac00171a028.
[2] Spengler, B.; Hubert, M.; Kaufmann, R. In Proceedings of the 42nd annual conference on mass spectrometry and allied topics, Chicago, Illinois, USA. 1994, 1041.
[3] Bartels, B.; Kulkarni, P.; Danz, N.; Bocker, S.; Saluz, H. P.; Svatos, A. RSC Advances 2017, 7, 15, 9045–9050, DOI: 10.1039/C6RA26854D.
[4] Nguyen, S. N.; Liyu, A. V.; Chu, R. K.; Anderton, C. R.; Laskin, J. Anal. Chem. 2017, 89, 2, 1131–1137, DOI: 10.1021/acs.analchem.6b03293.
[5] Paine, M. R. L.; Kooijman, P. C.; Fisher, G. L.; Heeren, R. M. A.; Fernandez, F. M.; Ellis, S. R. Journal of Materials Chemistry B 2017, 5, 36, 7444–7460, DOI: 10.1039/C7TB01100H.
[6] Kompauer, M.; Heiles, S.; Spengler, B. Nat. Methods 2017, 14, 1, 90–96, DOI: 10.1038/nmeth.4071.
[7] Kompauer, M.; Heiles, S.; Spengler, B. Nat. Methods 2017, advance online publication, DOI: 10.1038/nmeth.4433.

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Heinrich-Buff-Ring 17
35392 Gießen, Hessen
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Telefon: 0641 99 34531

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