Die Herstellung von chemischen Grundstoffen: Biokatalytische Detoxifizierung von Lignocellulosehydrolysaten

  • SPME-Erweiterung für GCSPME-Erweiterung für GC
  • SPME-Erweiterung für GC
  • Abb. 1: Extraktion einer Probe mit der SPME-Faser; (A) Einstechen der SPME-Halterung in das Probengefäß, (B) Ausfahren der SPME-Faser und Extraktion der Analyten, (C) Entfernen der SPMEHalterung aus dem Probengefäß, (D) Einstechen der SPME-Halterung in GC Injektor bzw. LC Interface, (E) Desorption der Analyten, (F) Entfernen der SPME-Halterung aus GC Injektor bzw. LC Interface (adaptiert nach Pawlyszin 2009)
  • Abb. 2: Mögliche Reaktionswege eines Lignin-Modellsubstrates nach Oxidation durch Laccase (adaptiert nach Arora & Sharma 2010; Leonowicz et al 2001; Wong 2009)
  • Abb. 3: Relative Konzentrationen repräsentativer phenolischer Monomere in einer Lignocellulose-Aufschlusslösung nach Inkubation mit 0,2 U/ml Laccase über einen Zeitraum von 7 Tagen bei 45 °C, 200 rpm und pH 5,0 (Analyse mittels HS-SPME/GC-MS)
  • Abb. 4: Größenausschluss-Chromatographie der Aufschlusslösung bei Reaktion mit Laccase (0,2 U / ml, 45°C, 200 rpm) nach 1, 24, 48 und 96 h; (Gerät: Äktamicro, Säule: HiPrep Desalting Sephadex, beide Fa. GE Healthcare; Laufmittel NaAcetatpuffer pH 5,0, Fluss 4,0 ml / min; Detektion bei 280 nm)
  • Tab. 1: Zusammenstellung der in einer Aufschlusslösung von hydrothermal vorbehandeltem Weizenstroh hauptsächlich identifizierten monomeren phenolischen Komponenten

Die biotechnologische Produktion von chemischen Grundstoffen aus nachwachsenden Rohstoffen war in den letzten Jahren Gegenstand zahlreicher Forschungs- und Entwicklungsarbeiten. Neben der lange etablierten Produktion von Ethanol wurden Verfahren für chemische Grundbausteine wie Bernsteinsäure, 2,3 Butandiol oder Hydroxypropionsäure u. a. bis in den Pilotund teilweise Produktionsmaßstab gebracht.

Hintergrund

Gemeinsam ist diesen Verfahren, dass sie Zucker und Stärke als Rohstoffe verwenden und damit mit der menschlichen Ernährung konkurrieren. Damit dies vermieden werden kann, steht seit einigen Jahren Lignocellulose im Fokus des F&E Interesses für die Gewinnung von Energieträgern und eben auch als Rohstoff für eine nachhaltige Produktion von chemischen Grundstoffen. Als Gerüstsubstanz von Landpflanzen kommt Lignocellulose praktisch ubiquitär in großen Mengen vor und ist, da sie nachwächst, quasi unerschöpflich.

Ihr hoher Anteil an Zuckern in Form von Polysacchariden macht sie interessant für die Umsetzung mit fermentierenden Mikroorganismen oder mit Enzymen. Ein bereits relativ weit entwickeltes Anwendungsgebiet ist die fermentative Gewinnung von Bioethanol aus Lignocelluloserohstoffen, wie Getreide- oder Maisstroh, Gräsern oder Holzfraktionen. Der Prozess beruht zumeist auf einer chemischen oder enzymatischen Hydrolyse der Polysaccharide zu den jeweiligen Monosacchariden, die anschließend zum Zielprodukt fermentiert werden [1].

Toxische Phenole

Lignocellulose ist biologisch relativ schwer angreifbar, so dass für eine erfolgreiche enzymatische Hydrolyse vorab eine chemische oder physikalisch-chemische Vorbehandlung zur Desintegration des Lignin-Polysaccharidverbundes erfolgen muss [2]. Die Vorbehandlung geht in der Regel mit einer mehr oder weniger umfangreichen Delignifizierung der Matrix einher.

Dabei werden monomere, oligomere und polymere phenolische Substanzen freigesetzt bzw. gebildet, die inhibierend gegenüber saccharolytischen Enzymen, vor allem aber gegenüber Fermentationsorganismen, wirken können [3]. Die fermentative Verarbeitung solcher Aufschlussprodukte zur Produktion der eigentlichen Grundchemikalien erfordert also eine vorherige Entfernung dieser Hemmstoffe.

Extensives Waschen oder Filtrieren mit Aktivkohle ist teilweise erfolgreich aber sehr teuer.

Eine kostengünstigere Alternative könnte sein, die toxischen Stoffe der Lignozelluloseaufschlüsse mit Enzymen umzusetzen, z. B. zu spalten oder querzuvernetzen. Am Lehrstuhl für Chemie Biogener Rohstoffe der TU München wurde die Entfernung verschiedener potentiell toxischer monomerer ligninstämmiger Phenole mit Hilfe einer Laccase aus dem Weißfäulepilz Trametes versicolor näher untersucht [4].

Hierbei zeigte sich, dass die Analytik dieser heterogenen Gemische von wasserlöslichen Substanzen nicht trivial ist. Daher wurde zunächst eine modifizierte GC-MS-Analytik entwickelt, die es ermöglichte, die Zielsubstanzen ohne vorherige Extraktion mit Lösungsmitteln oder aufwändige Aufarbeitungsschritte direkt aus der komplexen Matrix der Lignocellulose- Aufschlusslösungen zu bestimmen.

Das Prinzip dieser, als Headspace-Solid Phase Microextraction/ GC-MS (HS-SPME/GC-MS) bekannten, von Pawliszyn [5] beschriebenen Methode beruht auf einer lösungsmittelfreien Festphasenextraktion an sehr dünnen Fasern mit Polydimethylsiloxanen, Polyacrylaten oder Polyethylenglykol als Grundsubstanz. Abbildung 1 verdeutlicht das Prinzip der SPME-Extraktion.

Die Faser wird je nach Analyt gewählt, wobei zwischen polaren, unpolaren, flüchtigen und schwer flüchtigen Substanzklassen unterschieden wird. Weiterhin existieren zwei SPME-Hauptextraktions-methoden: das direkte Eintauchen der Faser in die Probenlösung (direct immersion DI) und die Extraktion über den Gasraum (headspace HS).

Material und Methoden

Im vorliegenden Fall wurde eine Polyacrylatfaser (Supelco) eingesetzt und nach der Headspace- Variante gearbeitet, um Verunreinigungen der Faser durch hochmolekulare und sonstige nicht flüchtige Bestandteile der Probenmatrix zu vermeiden. Eingesetzt wurde ein Thermo Finnigan Trace GC 2000 mit einem Trace DSQ und TriPlus Autosampler.

Die Proben wurden in 10 ml Headspace- Vials vorgelegt, auf pH 5,0 gepuffert, mit 0,5 g NaCl und Ethylvanillin als internem Standard (1 mM) versetzt, so dass sich ein Gesamtvolumen von 1 ml ergab. Die Temperatur des Headspaceofens betrug 70 °C, die Inkubationszeit 0,5 min, die Extraktionszeit 30 min und die Desorptionszeit 2 min. Nach Desorption wurde die Faser für 10 min bei 280 °C ausgeheizt.

Für die GC-MS - Analyse wurde eine mit 0,25 μm 5 % Phenyl cross-bond Film beschichtete SLB- 5ms Säule (Supelco) verwendet. Die Ofentemperatur wurde 2 min bei 80 °C gehalten, anschließend auf 110 °C (10 °C / min), auf 160 °C (3 °C / min), sowie auf 280 °C (20 °C / min) hochgefahren. Diese Temperatur wurde zum Ausheizen der Säule für 10 min gehalten. Die MS Transfer Line wurde auf 250 °C aufgeheizt, die Injektion erfolgte splitless bei 280 °C. Als Carrier-Gas wurde Helium mit einem Fluss von 1,0 ml / min eingesetzt. Zur Identifizierung der Substanzen wurden Referenzchemikalien bzw. die NIST Bibliothek herangezogen.

Mit dieser Methode wurden monomere phenolische Komponenten in den Aufschlusslösungen von hydrothermal vorbehandeltem Weizenstroh identifiziert und ihre Konzentration vor und nach der Laccase-Behandlung ermittelt. Tabelle 1 zeigt die in der Aufschlusslösung identifizierten Substanzen.

Biokatalytische Entfernung von ligninstämmigen Monomeren

Durch Einsatz von Laccasen kann die Entfernung ligninstämmiger phenolischer Substanzen aus den Aufschlusslösungen auf biokatalytischem Wege erfolgen [6, 7]. Laccasen (EC 1.10.3.2.) sind, meist monomere, Enzyme mit bis zu vier Kupferionen im aktiven Zentrum, die in Pflanzen, Bakterien, Pilzen und Insekten gefunden wurden, in besonders großen Mengen aber von Weißfäulepilzen gebildet werden.

Laccasen oxidieren über Radikalmechanismen in Anwesenheit von Sauerstoff phenolische Strukturen im Lignin [8], können dabei aber auch freie Phenole polymerisieren, ein Effekt, den man zur Entfernung von ligninstämmigen Phenolen aus Lignocellulose-Aufschlusslösungen nutzen kann [9]. Abbildung 2 zeigt einige mögliche Reaktionswege. Beim Monitoring der biokatalytischen Reduktion der in der Aufschlusslösung identifizierten monomeren Phenole zeigte sich, dass diese unterschiedlich schnell mit der Laccase reagierten.

Während einige Substanzen, wie Ferulasäure, p- Coumarsäure, Guaiacol oder HPMA schon durch geringe Mengen Laccase sehr schnell entfernt werden konnten, reagierten andere, wie Vanillin, bei gleicher Laccaseaktivität (ausgedrückt in U / ml) erst nach mehrere Stunden annähernd vollständig ab, und einige, wie HBA, erst nach Tagen (Abb. 3). Eine Rolle scheinen dabei unter anderem Methoxysubstituenten an den Phenolen zu spielen.

Wie in anderem Zusammenhang beschrieben [10] scheint die Sensitivität strukturell verwandter Phenole gegenüber Laccase durch zusätzliche Methoxysubstituenten zuzunehmen. Soll Laccase zur Entfernung von Fermentationsinhibitoren eingesetzt werden, ist aber gerade den langsam reagierenden und daher schwer entfernbaren Substanzen und ihrem inhibitorischen Potenzial besonderes Augenmerk zu schenken.

Auch die vermutete Polymersierung der phenolischen Komponenten durch die Laccasebehandlung konnte durch ergänzende Messungen mit Hilfe der Größenausschlusschromatographie zumindest qualitativ bestätigt werden. Das Chromatogramm (Abb. 4) lässt durch die Reduktion der Bande bei ca. 50 ml und die Zunahme der Bande bei ca. 20 ml, deutlich die Verschiebung hin zu höhermolekularen Fraktionen mit fortschreitender Einwirkzeit der Laccase erkennen.

Ausblick

Die Zusammensetzung von Lignocellulose-Aufschlusslösungen kann sich hinsichtlich der enthaltenen (monomeren) ligninstämmigen Phenole abhängig von Rohstofftyp, Aufschlussverfahren und -bedingungen deutlich unterscheiden. Die hier eingesetzte HS-SPME/GCMS- Methode bietet eine elegante Möglichkeit, diese Matrices schnell, mit hohem Durchsatz und kleinen Probenvolumina diesbezüglich zu charakterisieren. Mit Laccasen kann die Konzentration einiger toxischer Phenole beeinflusst und reduziert werden. Damit ist die Grundlage gelegt, Lignozellulose effizient als Rohstoffquelle für die mikrobielle Produktion von Chemikalien zu verwenden.

Literatur

[1] Talebnia F. et al.: Bioresour Technol, 101, 4744– 4753 (2010)

[2] Alvira P. et al.: Bioresource Technology, 101, 4851– 4861 (2010)

[3] Palmqvist E. Hahn-Hägerdal, B. Bioresour Technol, 74, 25–33 (2000)

[4] Kolb M. et al.: Bioresource Technology, 104, 298– 304 (2012)

[5] Pawliszyn J. Handbook of Solid Phase Microextraction. Chemical Industry Press, Beijing (2009)

[6] Chandel A.K. et al.: Bioresource Technology, 98, 1947–1950 (2007)

[7] Martín C. et al.: Enzyme Microb Technol, 31, 274– 282 (2002)

[8] Leonowicz A.et al.: J. Basic Microbiol., 41, 185–227 (2001)

[9] Jurado M. et al.: Bioresource Technology, 100, 6378–6384 (2009)

[10] Jarosz-Wilkolazka A.et al.: Talanta, 66, 1219–1224 (2005)

▶ ▶Kontakt

Prof. Dr. Volker Sieber

Lehrstuhl für Chemie Biogener Rohstoffe

Technische Universität München Straubing

sieber@tum.de

Autor(en)

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.