Die Säule

Das Herzstück der Chromatographie

  • Abb.1: Schematische Darstellung der van-Deemter Kurve (hellblau) durch Addition des A-Terms (Eddy-Diffusion, grün), des B-Terms (longitudinale Diffusion, rot) und des C-Terms (Massenaustauschphänomene, dunkelblau).Abb.1: Schematische Darstellung der van-Deemter Kurve (hellblau) durch Addition des A-Terms (Eddy-Diffusion, grün), des B-Terms (longitudinale Diffusion, rot) und des C-Terms (Massenaustauschphänomene, dunkelblau).
  • Abb.1: Schematische Darstellung der van-Deemter Kurve (hellblau) durch Addition des A-Terms (Eddy-Diffusion, grün), des B-Terms (longitudinale Diffusion, rot) und des C-Terms (Massenaustauschphänomene, dunkelblau).
  • Abb.2: Resultierende van-Deemter Kurven für drei Trennsäulen (50 x 0,3 mm) für a) Etoposid und b) Naphthalin bei einer Temperatur von 30°C.

Die Säule ist nach wie vor das Herzstück der Chromatographie. Während es in den letzten Jahren gelungen ist, immer kleinere Partikel bis zu einem Durchmesser von 1 µm reproduzierbar herzustellen, ist das Packen einer HPLC-Säule nach wie vor eine der größten Herausforderungen.

Am 6. August 2012 landete der NASA-Rover Curiosity auf dem Mars. Es handelte sich um eine der anspruchsvollsten Missionen zu einem anderen Himmelskörper. Aufgrund des enormen Gewichts des Mars-Rovers von rund einer Tonne, musste ein neues Verfahren zur sicheren Landung ausprobiert werden. Obwohl das Verfahren noch nie vorher eingesetzt worden war, verlief alles wie geplant. Kleine Partikel für HPLC-Trennungen auf der Erde in Säulen mit einem Innendurchmesser (ID) von 300 µm zu packen, sodass eine hohe Batch-to-Batch Reproduzierbarkeit erhalten wird, ist nach wie vor ein schwieriges Unterfangen. Vor diesem Hintergrund ist die kommerzielle Verfügbarkeit miniaturisierter HPLC-Säulen immer noch eingeschränkt.

Trenneffizienz

Seitens vieler Anwender wird die Trenneffizienz und Robustheit von Mikro-LC-Säulen im Vergleich zu Säulen mit einem ID zwischen 2,1 mm und 4,6 mm geringer eingestuft. Ob diese Vorurteile berechtigt sind, wurde anhand eigener Untersuchungen näher beleuchtet. Grundlage für die Bewertung der Trenneffizienz war die van-Deemter Analyse, die nachfolgend kurz erläutert wird.

In Abbildung 1 ist der typische Verlauf einer van-Deemter Kurve dargestellt. Hierbei wird die Bodenhöhe H gegen die lineare Fließgeschwindigkeit u0 aufgetragen. Die in Abbildung 1 hellblau dargestellte van-Deemter Kurve ergibt sich aus der Überlagerung mehrerer Terme. Der A-Term, auch als Eddy-Diffusion bezeichnet, beschreibt die Abhängigkeit der Bodenhöhe vom Partikeldurchmesser und gilt als Maß für die Homogenität der Packung. Generell führen kleinere Partikel immer zu einem kleineren A-Term. Der B-Term, auch als longitudinale Diffusion bezeichnet, führt insbesondere bei sehr kleinen Flussraten zu einer starken Bandenverbreiterung (B-Term Region). Unter realen Bedingungen spielt die longitudinale Diffusion meistens keine Rolle, weil die eingestellte Fließgeschwindigkeit deutlich oberhalb des kritischen Bereichs liegt.

Bei hohen Fließgeschwindigkeiten dominiert deshalb der C-Term, der die Massenaustauschphänomene zwischen Analyt, stationärer und mobiler Phase umfasst (C-Term Region). Bei Partikeln mit einem Durchmesser von 3 µm und größer wird i. d. R. ein steiler Anstieg des C-Terms mit Zunahme der Flussrate beobachtet, wohingegen bei sub 2 µm Partikeln nur ein flacher Anstieg resultiert. Kleine Partikel wirken sich somit günstig auf den A- und C-Term aus und führen zu einer geringen Bodenhöhe. Für jede Trennsäule ergibt sich eine optimale Fließgeschwindigkeit (uopt), bei der die minimale Bodenhöhe und somit die höchste Effizienz erreicht wird. Diese Geschwindigkeit hängt von den Eigenschaften der Analyten und den chromatographischen Bedingungen ab.

van-Deemter Analyse

In Abbildung 2 sind die Ergebnisse einer van-Deemter Analyse für drei Mikro-LC Säulen mit einem ID von 300 µm dargestellt. Für die Untersuchungen wurden zwei Analyten mit unterschiedlichem Molekulargewicht ausgewählt, um deren Einfluss auf die van-Deemter Kurve zu demonstrieren.

Anhand der Daten aus Abbildung 2 a für den Analyten Etoposid ist ersichtlich, dass mit der Reduzierung des Partikeldurchmessers eine Abnahme der Bodenhöhe H beobachtet wird, was auf eine höhere Trennstufenanzahl N zurückzuführen ist. Je kleiner der Partikeldurchmesser ist, desto geringer ist auch die Steigung im C-Term. Ein anderes Bild ergibt sich, wenn anstelle von Etoposid mit einer molaren Masse von 588,57 g mol-1 Naphthalin mit einer molaren Masse von 128,17 g mol-1 verwendet wird. In diesem Fall weist die mit dem sub 2 µm-Material gepackte Säule erst bei linearen Fließgeschwindigkeiten von mehr als 4 mm s-1 eine geringere Bodenhöhe auf als die mit 2,7 µm teilporösen Partikeln gepackte Säule. Generell verschiebt sich die optimale Fließgeschwindigkeit für alle untersuchten Säulen zu höheren linearen Fließgeschwindigkeiten, was im Wesentlichen auf die schnellere Diffusion von Naphthalin gegenüber Etoposid zurückzuführen ist.

Packungsqualität

Hetzel et al. konnten anhand weiterer Auswertungen zeigen, dass die mit dem sub 2 µm-Material gepackte Trennsäule eine ähnliche Packungsqualität aufweist, wie analytische Säulen mit einem Innendurchmesser zwischen 2,1 mm und 4,6 mm. Die Packungsqualität wurde anhand der reduzierten Bodenhöhe hmin bewertet. Dieser dimensionslose Parameter wird erhalten, indem die Bodenhöhe am van-Deemter Minimum (Hmin) durch den Partikeldurchmesser dp geteilt wird:

Für sehr gut gepackte Säulen soll hmin einen Wert von ungefähr zwei annehmen, was bedeutet, dass sich das chromatographische Gleichgewicht auf zwei Lagen Körner der Füllung einmal einstellt. Die Angabe der reduzierten Bodenhöhe hat den weiteren Vorteil, dass Trennsäulen unterschiedlicher Länge und Innendurchmesser sowie unterschiedliche Korngrößen und Partikeltechnologien direkt miteinander verglichen werden können.

Effizienz

Die Diskussion über die Effizienz von Mikro-LC Säulen wird in der aktuellen wissenschaftlichen Literatur sehr kontrovers geführt. Wie bereits im Beitrag „Mikro-LC Grundlagen“ dargelegt wurde, müssen alle Systemvolumina, die zu einer Bandenverbreiterung führen, minimiert werden. Dies betrifft insbesondere das Injektionsvolumen und die Volumina der Verbindungskapillaren vom Injektor zur Trennsäule bei isokratischer Arbeitsweise sowie generell die Verbindungskapillare von der Trennsäule zum Detektor und das Volumen der Detektionszelle. Wird also für die Bestimmung der Packungsqualität bzw. Effizienz von Mikro-LC Säulen ein HPLC-System verwendet, dessen Systemvolumina einen signifikanten Beitrag zur Bandenverbreiterung leisten, sind die abgeleiteten Schlussfolgerungen irreführend. Denn die scheinbar schlechtere Effizienz von Mikro-LC Säulen ist in diesen Fällen auf den Einfluss der Außer-Säulen-Volumina auf die Bandenverbreiterung zurückzuführen.

Partikel

Darüber hinaus spielen der Partikeldurchmesser sowie die Partikelgrößenverteilung beim Packprozess eine entscheidende Rolle. Enge Partikelgrößenverteilungen führen zu einer Reduzierung des A-Terms, was auf eine homogenere Packung hinweist. Ein Beispiel für den Beleg dieser Annahme sind die sog. Core-Shell Materialien, die i. d. R. eine geringere Partikelgrößenverteilung als vollporöse Partikel aufweisen. Häufig wird angenommen, dass kleinere Partikel schwieriger zu packen sind als größere Partikel. In der von Hetzel et al. durchgeführten Studie für 300 µm ID Trennsäulen wurde beobachtet, dass die reduzierte Bodenhöhe hmin für eine stationäre Phase mit einem Partikeldurchmesser von 1,9 µm kleiner ist, als für eine Packung mit einem Partikeldurchmesser von 3,0 µm. Ein Erklärungsansatz für dieses Phänomen bildet das Verhältnis aus dem Innendurchmesser der Trennsäule zum Partikeldurchmesser der stationären Phase, das im Englischen als „aspect ratio“ bezeichnet wird. Dieses beträgt für einen Innendurchmesser von 300 µm 158 bzw. 100, wenn Partikel mit einer Korngröße von 1,9 µm bzw. 3,0 µm betrachtet werden. Aufgrund der Tatsache, dass Wandeffekte mit zunehmender Reduzierung des Innendurchmessers eine immer größere Rolle spielen, lässt sich mit kleineren Partikeln demzufolge eine bessere Packungsqualität erzielen. Dies wiederum würde bedeuten, dass sehr kleine Partikel mit einem Durchmesser um 1,0 µm, die aktuell Gegenstand der Forschung sind, in Kombination mit Mikro-LC Säulen eine sehr hohe Trenneffizienz aufweisen sollten. Dies gilt, wie bereits oben erwähnt, nur unter der Voraussetzung der konsequenten Minimierung aller Außer-Säulen Volumina. Genau dieser Frage geht ein am IUTA aktuell durchgeführtes Forschungsprojekt nach. Die Grundvoraussetzung hierfür ist allerdings, dass der Packprozess standardisiert ist und die Qualität der Packung nicht von äußeren Faktoren abhängt.

Fazit

Auch wenn wir immer komplexere Missionen zur Erkundung des Weltalls auf den Weg bringen, das Packen von HPLC-Säulen wird wohl noch auf einige Zeit eine anspruchsvolle Aufgabe bleiben. Mit den hier vorliegenden Daten konnten wir zeigen, dass die Qualität der Packung prinzipiell nicht vom Innendurchmesser der Trennsäule abhängt und dass Mikro-LC Säulen eine vergleichbare Effizienz aufweisen, wie analytische HPLC-Säulen. Allerdings kann die intrinsische Trenneffizienz von Mikro-LC Säulen nur dann vollständig genutzt werden, wenn Mikro-LC Systeme mit sehr geringen Außer-Säulen-Volumina verwendet werden.

Autoren
Thorsten Teutenberg1, Terence Hetzel2, Juri Leonhardt1

Zugehörigkeiten
1Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V., IUTA, Duisburg, Deutschland
2Bayer AG , Wuppertal

Kontakt
Dr. Thorsten Teutenberg
Bereichsleiter Forschungsanalytik & Miniaturisierung
Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V. (IUTA)
Duisburg, Deutschland
teutenberg@iuta.de

Projekt Fortschrittliche Chromatographie

Chemgapedia Lerneinheit(en) zur Micro-LC

Haben Sie Fragen zur Anwendung und Technik im Bereich Mikro-LC und 2D-LC? Fragen Sie die Experten vom IUTA: adlichrom@iuta.de

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Microsite Fortschrittliche Chromatographie


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