Einfluss von UV-Strahlung auf das Erbgut

RNA Strang beeinträchtigt Photostabilität von Uracil

  • Abb. 1: (a) Potentialfläche des hellen ππ*-Zustands S2 von Uracil mit Einzeichnung des Franck-Condon Punktes (FC), dem S2-Minimum und einer konischen Durchschneidung (CoIn) nach S1. (b) und (c) Beispielhafte Propagationen eines Kernwellenpakets auf zwei durch die Umgebung veränderten Potentialflächen nach 0 fs (schwarz), 50 fs (grau) und 500 fs (weiß). In (b) ist S2  nach 500 fs bereits vollständig depopuliert.Abb. 1: (a) Potentialfläche des hellen ππ*-Zustands S2 von Uracil mit Einzeichnung des Franck-Condon Punktes (FC), dem S2-Minimum und einer konischen Durchschneidung (CoIn) nach S1. (b) und (c) Beispielhafte Propagationen eines Kernwellenpakets auf zwei durch die Umgebung veränderten Potentialflächen nach 0 fs (schwarz), 50 fs (grau) und 500 fs (weiß). In (b) ist S2 nach 500 fs bereits vollständig depopuliert.
  • Abb. 1: (a) Potentialfläche des hellen ππ*-Zustands S2 von Uracil mit Einzeichnung des Franck-Condon Punktes (FC), dem S2-Minimum und einer konischen Durchschneidung (CoIn) nach S1. (b) und (c) Beispielhafte Propagationen eines Kernwellenpakets auf zwei durch die Umgebung veränderten Potentialflächen nach 0 fs (schwarz), 50 fs (grau) und 500 fs (weiß). In (b) ist S2  nach 500 fs bereits vollständig depopuliert.
  • Abb. 2: Zeitliche Entwicklung der Population im zweiten elektronisch angeregten Zustand S2 von Uracil in 250 verschiedenen Schnappschüssen der Umgebung. Die schwarze Referenzkurve entspricht der Relaxation der isolierten Base ohne Umgebungseinfluss mit einer Halbwertszeit von 192 fs. Die Farbskala der übrigen Kurven codiert, wie sehr die Halbwertszeit von der Referenz abweicht.
  • Abb. 3: Relatives Auftreten von langsameren, ähnlichen und schnelleren Relaxationszeiten von Uracil in einem RNA-Strang, abhängig von den benachbarten Nukleobasen. Die RNA-Sequenz war 5‘-GA-XUY-GG-3‘, wobei X und Y die getesteten Nachbarbasen bezeichnen. Als Referenz diente die Relaxationszeit der isolierten Base ohne Umgebungseinfluss (192 fs).
Nukleobasen, die Bausteine des genetischen Codes, können durch UV-Strahlung zu chemischen Reaktionen angeregt werden, was schädliche Mutationen zur Folge haben kann. Alle Nukleobasen sind allerdings auch in der Lage, die aufgenommene Energie ultraschnell an ihre Umgebung abzugeben, wodurch die Wahrscheinlichkeit für Photoschäden stark gesenkt wird.  Für die isolierten Moleküle sind solche Prozesse gut untersucht. Mithilfe von quantendynamischen Simulationen konnte nun gezeigt werden, dass der Einfluss einer natürlichen Umgebung die Photostabilität der Nukleobase Uracil senkt.

UV-Strahlung kann das Erbgut beschädigen

Die Nukleinsäuren DNA und RNA sind sehr gute Chromophore im ultravioletten (UV) Bereich. Absorption von UV-Strahlung führt zur Anregung der Basen in einen hellen, energetisch höher liegenden elektronischen Zustand, von wo aus sich neue Wege zur Reaktion mit Nachbarbasen und damit zur Entstehung von Mutationen eröffnen. Der häufigste so entstehende Photoschaden ist das CyclobutanPyrimidin-Dimer (CPD), das sich zwischen benachbarten Thymin-, Cytosin- oder Uracil-Einheiten bilden kann. Die [2+2]-Photocycloaddition kann bei günstiger Geometrie der Basen im DNA-Strang innerhalb von nur einer Pikosekunde nach UV-Anregung stattfinden [1].
Nichtsdestotrotz weisen alle fünf kanonischen Nukleobasen im Vergleich zu verwandten Verbindungen  eine besonders hohe Photostabilität auf. Absorbierte Energie kann innerhalb weniger hundert Femtosekunden wieder an die Umgebung abgegeben werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit für UV-bedingte Mutationen stark gesenkt wird. Die ultraschnelle Relaxation wird auf die Existenz von konischen Durchschneidungen zurückgeführt, die den hellen angeregten Zustand mit energetisch niedrigeren elektronischen Zuständen verbinden und so einen strahlungslosen Pfad in den Grundzustand öffnen. Werden diese ultraschnellen Relaxationspfade hingegen blockiert und der angeregte Zustand bleibt länger besetzt, steigt die Gefahr für Photoschäden [2-4]. Am Beispiel der isolierten RNA-Base Uracil wurde mithilfe quantendynamischer Rechnungen bereits demonstriert, wie die ultraschnelle Relaxation aus dem hellen S2-Zustand mit ππ*-Charakter in den darunterliegenden nπ*-Zustand S1 unter Laborbedingungen durch optimierte Laserpulse behindert werden kann [5].
Unter natürlicheren Bedingungen werden langlebige angeregte Zustände in DNA und RNA häufig auf eine Delokalisierung der Anregung über mehrere Basen zurückgeführt.

Dies kann beispielsweise durch die Bildung von Elektron-Loch-Paaren (Exzitonen) oder die Bildung angeregter Komplexe (Exciplexe) zwischen zwei Nachbarbasen geschehen und ist gut untersucht [6-9]. Eine quantendynamische Studie zeigt nun, dass auch der monomerartige Relaxationskanal von Uracil im UV-angeregten Zustand durch die natürliche Umgebung stark behindert werden kann, ohne dass es zur Delokalisierung kommen muss [10].

RNA Strang verändert die Energielandschaft im angeregten Zustand

Im Formalismus der Quantendynamik werden Molekülbewegungen durch Wellenpakete, die sich in einem elektronischen Potential bewegen, simuliert. Dieses wird durch die Lösung der elektronischen Schrödingergleichung bei verschiedenen Kerngeometrien ermittelt, wodurch sich eine Potentialenergiefläche ergibt. Kernwellenpakete, welche sich auf dieser Fläche bewegen, können im Sinne von Aufenthaltswahrscheinlichkeitsdichten bei den jeweiligen Molekülstrukturen interpretiert werden.
Eine solche Energielandschaft wurde zunächst für den hellen S2-Zustand von isoliertem Uracil berechnet (Abb. 1a). Sie enthält die Molekülstruktur am Franck-Condon Punkt, das Minimum des angeregten Zustands, sowie den davon durch eine Energiebarriere abgetrennten Saum einer konischen Durchschneidung zu S1. In diesem zweidimensionalen Raum wird die Molekülbewegung während des ersten ultraschnellen Relaxationsschrittes von S2 nach S1 gut abgebildet [5]. Mithilfe von gemischt quantenmechanischen/klassischen Rechnungen (QM/MM) wurde anschließend der Umgebungseinfluss einer natürlichen Umgebung, bestehend aus einem RNA Strang und Wassermolekülen, auf diese Potentialfläche ermittelt. Um der strukturellen Flexibilität der Umgebung Rechnung zu tragen, wurden insgesamt 250 solcher Potentialflächen für jeweils verschiedene Umgebungskonformationen berechnet. Der überwiegende Großteil der Potentiale ähnelte stark dem der isolierten Base. Dennoch zeigte sich in wenigen Fällen, dass die Einbettung von Uracil in einen RNA Strang starke Veränderungen der elektronischen Potentialfläche nach sich ziehen kann (Abb. 1b und c).
Die beobachteten Effekte reichten von (de-)stabilisierten Minima über höhere oder niedrigere Energiebarrieren zwischen dem S2-Minimum und der konischen Durchschneidung bis hin zur Bildung zusätzlicher Minima. Als mögliche Ursachen solch drastischer Veränderungen konnten vor allem Wasserstoffbrückenbindungen von Uracil zu benachbarten Basen oder dem Zucker-Phosphat-Rückgrat des RNA-Stranges identifiziert werden. Auch günstige Wechselwirkungen mit Wassermolekülen sind möglich. Destabilisierende Wechselwirkungen sind hauptsächlich auf die sterische Einschränkung der zur Relaxation nötigen Bewegung durch die Umgebung zurückzuführen.

Topographie des elektronischen Potentials steuert Relaxationszeit

Durch Propagation eines Kernwellenpakets auf den so veränderten S2-Potentialflächen und Simulation der Kopplung nach S1 lässt sich der Einfluss der Umgebung auf die Lebenszeit von Uracil im hellen S2-Zustand untersuchen. Für alle weitere Betrachtungen dient die Halbwertszeit t1/2 von 192 fs, nach der der S2-Zustand in der isolierten Base nur noch zu 50 % bevölkert ist, als Referenzwert. Zwei beispielhafte Propagationen sind in Abbildung 1b und c gezeigt. Dabei startet das Wellenpaket jeweils am Franck-Condon Punkt und bewegt sich zunächst in Richtung des S2-Minimums, bevor es durch die konische Durchschneidung nach S1 koppelt und den energetisch niedrigeren Zustand besetzt. Der für die Lebenszeit in S2 entscheidende Faktor ist dabei, wie gut die konische Durchschneidung für das Wellenpaket erreichbar ist. Daher kann die veränderte Topographie der Potentialfläche die Relaxation entweder beschleunigen (Abb. 1b) oder verlangsamen (Abb. 1c). Von besonderer Bedeutung sind in diesem Zusammenhang die Bereiche um den Franck-Condon Punkt, sowie über dem S2-Minimum, wo das Wellenpaket während der Propagation an der Potentialwand reflektiert wird. Die Richtung des Energiegradienten an diesen Stellen bestimmt im Zusammenspiel mit der Quantenkohärenz des Wellenpaketes, ob die konische Durchschneidung schnell oder langsam erreicht wird. In Abbildung 1b wird das S2-Minimum von oben durch eine Energiebarriere durchschnitten. Das am Franck-Condon Punkt startende Wellenpaket trifft frontal auf diese Barriere und spaltet sich auf, wodurch ein großer Anteil in die Richtung der konischen Durchschneidung abgelenkt wird. Die Relaxationszeit ist dementsprechend wesentlich schneller (t1/2 = 76 fs) als in der isolierten Base. Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 1c eine Potentialfläche mit deutlich abgesenkter Energiebarriere zwischen S2-Minimum und konischer Durchschneidung. Obwohl der Relaxationspfad nicht energetisch gehindert ist, oszilliert das Kernwellenpaket für mehr als eine Pikosekunde (t1/2 = 1,5 ps) zwischen Franck-Condon Punkt und dem S2-Minimum. Dieses kontraintuitive Verhalten lässt sich auf minimale topographische Veränderungen an den beiden erwähnten Reflexionspunkten zurückführen, wodurch dem kohärenten Wellenpaket der nötige Impuls zur konischen Durchschneidung fehlt.

RNA Strang ermöglicht verzögerte Relaxation aus S2

Die in Abbildung 1b und c gezeigten Beispiele stellen ausgesuchte Extremfälle dar, an denen sich der Umgebungseinfluss besonders gut zeigen lässt. Von den durchgeführten quantendynamischen Simulationen in insgesamt 250 unterschiedlichen Umgebungskonformationen bewegten sich 82 % der Lebenszeiten in einem Bereich von 50 fs um den Referenzwert von 192 fs. In 5 % der Fälle konnte schnellere Relaxation beobachtet werden, während der S2-Zustand in 13 % der Simulationen langsamer entvölkert wurde (Abb. 2).
Der hohe Anteil ähnlich schneller und sogar schnellerer Relaxationszeiten wie in der isolierten Base demonstriert die hohe Photostabilität von Uracil in seiner natürlichen Umgebung. Nichtsdestotrotz kann der sterische und elektrostatische Einfluss eines RNA Stranges auch dazu führen, dass die Base längere Zeit im angeregten Zustand verweilt, was die Entstehung von Photoschäden prinzipiell begünstigt. Die längsten aus der Quantendynamik extrahierten Lebenszeiten betrugen über 3,5 ps – bei günstiger Ausgangsstellung der Nachbarbasen zeitlich ausreichend für die Entstehung von CPD-Schäden [1]. Da das verwendete Modell keine Delokalisierungseffekte beinhaltet, entspringen diese verzögerten Relaxationszeiten tatsächlich nur dem Umgebungseinfluss auf den monomerartigen Abbaukanal. Die theoretische Betrachtung ermöglicht somit eine getrennte Untersuchung verschiedener Effekte, die sich im Experiment überlagern würden. Ein weiterer Vorteil der theoretischen Herangehensweise ist, dass die seltenen Fälle verzögerter Relaxation gezielt analysiert werden können, während in Experimenten nur die mittlere Lebensdauer des angeregten Zustands zugänglich ist.

Kombination der Nachbarbasen vernachlässigbar

Auch der Einfluss unterschiedlicher Kombinationen benachbarter Basen auf die Relaxationszeit wurde untersucht. Aus diesem Grund wurden die zuvor diskutierten Umgebungspotentiale in insgesamt zehn verschiedenen RNA Sequenzen berechnet und Lebenszeiten in S2 in Abhängigkeit der Nachbarbasen aufgetragen (Abb. 3). Dabei zeigte sich, dass die Relaxationszeiten nahezu unabhängig von der spezifischen Kombination benachbarter Nukleobasen sind. Die diskutierten Effekte sind somit auf den allgemeinen sterischen und elektrostatischen Einfluss der molekularen Umgebung zurückzuführen und weniger auf spezifische Interaktionen zwischen den Basen.

Fazit

Durch quantendynamische Rechnungen unter expliziter Einbeziehung von Umgebungseffekten konnte ein neuer Mechanismus aufgezeigt werden, der zu verzögerter Relaxation von Uracil nach UV-Anregung führt und so möglicherweise zur Entstehung von Photoschäden in RNA beiträgt.



Danksagung

Die Autoren danken Spiridoula Matsika für die ergiebige Zusammenarbeit in einer früheren Studie, die die Grundlage für diese Arbeit bildet. Für die finanzielle Unterstützung gilt der Dank dem Exzellenzcluster MAP und dem SFB749 der Deutschen Forschungsgemeinschaft. Dem Leibniz-Rechenzentrum in München wird für die Ermöglichung dieser Studie durch die bereitgestellten Ressourcen gedankt. D. K. dankt der Dr. Klaus Römer Stiftung für finanzielle Unterstützung.

 

Autoren
Sebastian Reiter1, Daniel Keefer1, Regina de Vivie-Riedle1

Zugehörigkeit
1Department Chemie, Ludwig-Maximilians-Universität München, München, Deutschland.

Kontakt
Dr. Regina de Vivie-Riedle

Department Chemie
Ludwig-Maximilians-Universität München
München, Deutschland
Regina.de_Vivie@cup.uni-muenchen.de

Referenzen

[1] W. J. Schreier, T. E. Schrader, F. O. Koller, P. Gilch, C. E. Crespo-Hernández, V. N. Swaminathan, T. Carell, W. Zinth, B. Kohler, Science 2007, 315, 625–629.
[2] S. Tommasi, M. F. Denissenko, G. P. Pfeifer, Cancer Res. 1997, 57, 4727–4730.
[3] L. Esposito, A. Banyasz, T. Douki, M. Perron, D. Markovitsi, R. Improta, J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 10838–10841.
[4] L. Martínez-Fernandez,  A. J. Pepino, J. Segarra-Martí, J. Jovaišaitė, I. Vaya, A. Nenov, D. Markovitsi, T. Gustavsson, A. Banyasz, M. Garavelli , R. Improta, J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 7780–7791.
[5] D. Keefer, S. Thallmair, S. Matsika, R. de Vivie-Riedle, J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 5061–5066.
[6] C. E. Crespo-Hernández, B. Cohen, B. Kohler, Nature 2005, 436, 1141–1144.
[7] U. Kadhane, A. I. S. Holm, S. V. Hoffmann, S. B. Nielsen, Phys. Rev. E 2008, 77, 021901.
[8] D. Markovitsi, T. Gustavsson, A. Banyasz, Mut. Res. Rev. Mut. 2010, 704, 21–28.
[9] J. Chen, Y. Zhang, B. Kohler, in Photoinduced Phenomena in Nucleic Acids II (Eds.: M. Barbatti, A. Borin, S. Ullrich), Springer International Publishing, Switzerland, 2014, pp. 39–87.
[10] S. Reiter, D. Keefer, R. de Vivie-Riedle, J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 8714–8720.

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