Einzelmolekülkraftspektroskopie von kovalenten Bindungen

  • Abb. 1: Die verschiedenen Phasen einer Messung bei der Einzelmolekülkraftspektroskopie von kovalenten Bindungen mit dem Rasterkraftmikroskop am Beispiel eines Oligosaccharids.Abb. 1: Die verschiedenen Phasen einer Messung bei der Einzelmolekülkraftspektroskopie von kovalenten Bindungen mit dem Rasterkraftmikroskop am Beispiel eines Oligosaccharids.
  • Abb. 1: Die verschiedenen Phasen einer Messung bei der Einzelmolekülkraftspektroskopie von kovalenten Bindungen mit dem Rasterkraftmikroskop am Beispiel eines Oligosaccharids.
  • Abb. 2: Einzelmolekülexperiment mit einem spezifisch synthetisierten Cyclobutan-Mechanophor. Die Sicherheitsleine mit definierter Länge hält nach der mechanochemischen  Cycloreversion des Cyclobutans die Fragmente zusammen. Die Längenänderung lässt sich aus der Kraftkurve ablesen.
  • Abb. 3: Typische Kraftkurven für den Cyclobutan-Mechanophor mit (a) kurzer und (b) langer Sicherheitsleine. Die beobachtete Längenänderung entspricht den Vorhersagen aus quantenchemischen Rechnungen. Adaptiert mit Genehmigung von [2]. © 2016 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
Michael Pill1, Katharina Holz2, Ulrich Lüning2, Hauke Clausen-Schaumann1, Martin K. Beyer3
 
Neben eindrucksvollen Bildern aus der Nanowelt bietet das Rasterkraftmikroskop (engl. Atomic Force Microscope, kurz AFM) auch die Möglichkeit, die mechanischen Eigenschaften einzelner Polymermoleküle zu vermessen. Für diesen Forschungszweig hat sich der Begriff der Einzelmolekülkraftspektroskopie etabliert. Dazu werden Polymere mit Längen von 50 nm bis einigen µm auf eine Oberfläche gebracht und bei Bedarf kovalent verankert. Um nun ein einzelnes Molekül aus dieser Polymerlösung herauszufischen, wird die Cantileverspitze in Kontakt mit der Oberfläche gebracht, wo sie einige Zeit verweilt. Beim Wegfahren des Cantilevers zeigt sich, ob ein Polymer eine Bindung zur Spitze eingegangen ist, dann beobachtet man eine charakteristische Kraftkurve: Zunächst wird das Polymer gegen entropische Kräfte gestreckt (Abb. 1a). Bei α-1-4 verknüpften Polysacchariden beobachtet man an diesen Bereich anschließend ein Plateau bei einigen 100 pN, das dem Sessel-Wanne-Übergang entspricht, der hier mechanisch erzwungen wird (Abb. 1b). Um das Molekül noch weiter zu strecken, sind deutlich höhere Kräfte erforderlich, da jetzt kovalente Bindungen verlängert und Bindungswinkel aufgeweitet werden müssen. Schließlich kommt es zum Abriss des Moleküls, der durch die schnelle Relaxation des Cantilevers in seine Ruhelage charakterisiert ist (Abb. 1c). Hierbei reißt meist eine Bindung nahe an den Oberflächen.
 
Anwendung der Einzelmolekülkraftspektroskopie
 
Mit der Einzelmolekülkraftspektroskopie wurden elastische Eigenschaften und Konformationsübergänge einer Vielzahl von Polymeren untersucht. Diese Studien konzentrierten sich auf den Bereich einiger 10 pN bis einiger 100 pN. Um kovalente Bindungen und damit chemische Reaktionen zu aktivieren, sind in der Regel Kräfte über 500 pN bis zu einigen nN erforderlich. In diesem Kraftbereich ist immer auch der Abriss des Oberflächenankers möglich. Aus der Kraftkurve lässt sich ablesen, dass der Bruch einer kovalenten Bindung stattgefunden hat.

Es lässt sich aber nicht direkt sagen, welche Bindung für den Abriss verantwortlich war. Ebenso ist unklar, ob die Bindung homolytisch dissoziiert oder hydrolysiert wurde. Beide Fragen, die Identität der Bindung und der Mechanismus des Bindungsbruchs, müssen jedoch eindeutig beantwortet werden, um aus der Kraftkurve wissenschaftliche Aussagen ableiten zu können.

Vollständig gelungen ist dies bisher nur bei der Disulfidbindung [1]. Fernández und Mitarbeiter konnten die mechanisch aktivierte Reduktion des Cystins in einem künstlichen Protein kraftspektroskopisch charakterisieren. Dieser biochemische Zugang ist derzeit auf die Disulfidbindung beschränkt, da die Proteinchemie keine mechanisch stärkeren Quervernetzungen erlaubt. Um mechanisch stärkere Bindungen zu adressieren, müssen neue Synthesen entwickelt werden, und die Polymermoleküle müssen mit stabilen kovalenten Bindungen auf dem Substrat und an der Cantileverspitze verankert werden. 
 
Herstellung und Anwendung eines Cyclobutan-Mechanophors
 
Es wurde ein Mechanophor synthetisiert, der die mechanisch induzierte Cycloreversion des Cyclobutans zugänglich macht (Abb. 2) [2]. Für die Kraftspek-troskopie wird der Mechanophor über Ethoxysilan-terminierte Polyethylenglykol-Ketten kovalent verankert. Entscheidend dabei ist das Konzept der Sicherheitsleine. Parallel zur untersuchten Bindung (Abb. 2 blau) wird eine Molekülkette mit bekannter Länge eingebaut (Abb. 2 rot). Dissoziiert die Bindung, kommt es zu einer definierten Längenänderung des gesamten Moleküls, da die Sicherheitsleine nun gestreckt wird (Abb. 2 rechts). Diese Längenänderung wird im AFM detektiert und signalisiert den Bindungsbruch. Kraftkurven, bei denen mehr als ein Molekül herausgefischt wurde, lassen sich leicht aussortieren. In diesem Fall verläuft die Kraftkurve nach dem ersten Abriss deutlich flacher, da zwei gleichzeitig gestreckte Moleküle eine größere Kraftkonstante aufweisen als eines. Wird das Experiment wiederholt bei verschiedenen Kraftladungsraten und Temperaturen durchgeführt, lässt sich die Aktivierungsenergie der mechanisch aktivierten Dissoziation als Funktion der Kraft aus den Daten gewinnen. 
Der Cyclobutan-Mechanophor wurde in zwei Varianten mit verschieden langer Sicherheitsleine synthetisiert (Abb. 3 a und b), um jeden Zweifel an der Identität der dissoziierten Bindung zu beseitigen. Für die Einzelmolekülkraftspektroskopie wird der Mechanophor zwischen zwei Polyethylenglykol-Stränge eingebaut, die ihrerseits kovalent an Substrat- und Spitzenoberfläche verankert wurden. Durch die Struktur des Mechanophors und die Angriffspunkte der Kraft ist gesichert, dass das Auftreten der erwarteten Längenänderung in der Kraftkurve die Cycloreversion des Cyclobutans anzeigt.
Repräsentative Kraftkurven für die zwei verschiedenen Längen der Sicherheitsleine sind in Abbildung 3 gezeigt. Da vor und nach dem Öffnen des Makrozyklus dasselbe Polymermolekül gestreckt wird, hat die Kraftkurve nach dem ersten Abriss auch dieselbe Steigung wie davor. Durch die Sicherheitsleine ändert sich die Gesamtlänge des Moleküls nur um einige Prozent. Die gemessenen Längenänderungen entsprechen den theoretischen Voraussagen auf der Basis quantenchemischer Rechnungen, bei denen die anliegende Kraft mit der EFEI-Methode [3] berücksichtigt wurde. Damit ist es erstmals gelungen, mechanisch induzierte Bindungsbrüche bei Kräften über 1 nN direkt einer spezifischen chemischen Reaktion, der Cycloreversion des Cyclobutans, zuzuordnen.
Leider sind die verwendeten kovalenten Verankerungen an den Oberflächen schwächer als das Cyclobutan, so dass bevorzugt der Abriss des Oberflächenankers beobachtet wird. Aus diesem Grund konnte auch nicht die quantitativere Force-Clamp-Methode verwendet werden. Für einen breiteren Einsatz dieser Methode werden derzeit stärkere Oberflächenanker entwickelt. Durch die Synthese von Makrozyklen mit Sollbruchstellen, die weicher sind als das Cyclobutan, soll die Ausbeute an erfolgreichen Kraftkurven soweit erhöht werden, dass quantitative chemische Kinetik als Funktion der Kraft und Temperatur möglich wird, um die Mechanochemie kovalenter Bindungen auch experimentell auf eine quantitative Basis zu stellen.
 
Literatur
Alle Referenzen online unter:http://www.git-labor.de/forschung/chemie-physik/einzelmolekuelkraftspektroskopie-von-kovalenten-bindungen
 
Zugehörigkeit
1Hochschule München, Fakultät für angewandte Naturwissenschaften und Mechatronik, München, Deutschland
2Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Otto-Diels-Institut für Organische Chemie, Kiel, Deutschland
 
Kontakt
Prof. Martin K. Beyer

Universität Innsbruck
Institut für Ionenphysik und Angewandte Physik
Innsbruck, Österreich
martin.beyer@uibk.ac.at
 
Mehr zum Thema Atomic Force Mikroskopie: http://www.imaging-git.com/search/gitsearch/afm
 
Mehr Informationen zum Thema: http://www.verein-der-ingenieure.de/fileadmin/mediapool_vdi/arbeitskreise/mechatronik/doc/18.1.2012-schmidt.pdf
Referenzen

[1] A. P. Wiita, S. R. K. Ainavarapu, H. H. Huang, J. M. Fernández, P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006, 103, 7222–7227
[2] M. F. Pill, K. Holz, N. Preußke, F. Berger, H. Clausen-Schaumann, U. Lüning, M. K. Beyer, Chem. Eur. J. 2016. DOI: 10.1002/chem.201600866
[3] J. Ribas-Arino, D. Marx, Chem. Rev. 2012, 112, 5412-5487

Autoren
Michael Pill, Katharina Holz, Ulrich Lüning, Hauke Clausen-Schaumann, Martin K. Beyer
Universität Innsbruck, Institut für Chemische Physik, Innsbruck, Österreich

 

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