Elektronenspinresonanz (ESR)-Spektroskopie an Paramagnetischen Sonden

Analytik für thermoresponsive Polymere

  • Abb. 1: Beispielhafter Aufbau eines Benchtop ESR-Spektrometers  (hier: Magnettech Miniscope MS400, magnettech, Berlin).Abb. 1: Beispielhafter Aufbau eines Benchtop ESR-Spektrometers (hier: Magnettech Miniscope MS400, magnettech, Berlin).
  • Abb. 1: Beispielhafter Aufbau eines Benchtop ESR-Spektrometers  (hier: Magnettech Miniscope MS400, magnettech, Berlin).
  • Abb. 2: Graphische Illustration des Einsatzes der CW-ESR-Spektroskopie an Tempo-Sonden zur Untersuchung thermoresponsiver Polymere. a) TEMPO in polarer/wässeriger Umgebung (in blau, Spezies „B“) sowie Tempo in unpolarer Umgebung (in grün, Spezies „A“); b) Dazugehörige CW ESR-Spektren der Tempo-Spezies „A“ (blau) und „B“ (grün) sowie das Spektrum aus linearer Superposition der beiden, „A+B“ (schwarz). Ebenfalls gezeigt ist die Lage der isotropen g- und Hyperfeinwerte (giso und aiso). Die stärksten Unterschiede sind für die Linie bei höchstem Magnetfeld zu sehen (gepunkteter Kasten).
  • bb. 3: Graphische Illustration des Einsatzes der CW-ESR-Spektroskopie zur Untersuchung thermoresponsiver Polymere. a) Prinzipieller Aufbau von Pluronic (PEO-PPO-PEO Triblock-Copolymeren) sowie chemische Struktur der Radikalsonde Tempo b) Temperaturabhängige CW-ESR-Spektren von Tempo in Pluronic P84 [4]; c) Schematische Darstellung der Bildung nanoskopischer Heterogenitäten bzw. Mizellen bei erhöhter Temperatur, die Tempo-Sonden „einfangen“ können (Spezies „A“).

Einfache ESR-Spektroskopie kann nanoskopische Inhomogenitäten in einer Vielzahl thermoresponsiver Polymere entdecken und charakterisieren. Durch die Verfügbarkeit einfach zu bedienender Benchtop ESR-Spektrometer und einfacher Probenpräparation unter Zugabe von Nitroxidradikalen als Sonden, kann die continuous-wave-ESR-Spektroskopie an thermoresponsiven Polymeren als beinahe analytische Untersuchungsmethode angesehen werden.

Methoden der magnetischen Resonanzspektroskopie (MR) sind aus der modernen Forschung und Entwicklung sowie der Analytik nicht mehr wegzudenken. Dies gilt insbesondere für kernmagnetische Resonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance, NMR) an Festkörpern und v. a. an Flüssigkeiten. In der Mangetresonanzspektroskopie und -tomographie (MRT) wird die quantenmechanische Eigenschaft des Spins als Sonde eingesetzt, die tiefe Einblicke in den Aufbau der Materie liefert. Während die NMR-Spektroskopie in der akademischen und industriellen Forschung und Entwicklung vielfältig Einzug gehalten hat, ist die mit ihr verwandte Methode der Elektronenspinresonanz (ESR oft auch electron paramagnetic resonance, EPR) durch die Beschränkung auf die Detektion freier Radikale im Vergleich eine eher randständige Methode geblieben.

In diesem Beitrag wollen wir, nach einer kurzen Einführung in die Grundlagen der ESR-Spektroskopie, anhand eines aktuellen Beispiels zeigen, dass ESR-Spektroskopie an paramagnetischen Sondenmolekülen in der modernen Polymerforschung genutzt werden kann, um einzigartige Einblicke in die Nano-Struktur thermoresponsiver Polymere zu erhalten.

Physikalische und Technische Grundlagen
Die ESR-Spektroskopie ist eine Messmethode, bei der die Mikrowellenabsorption ungepaarter Elektronen in einem äußeren Magnetfeld gemessen wird. Das äußere Magnetfeld bewirkt hier eine Aufspaltung des magnetischen Dipolmoments in diskrete Energieniveaus (Zeeman-Effekt). Somit ist es möglich, die Elektronenspins selektiv mit Mikrowellen anzuregen und spektroskopisch zu untersuchen.

Wie in Abbildung 1 schematisch gezeigt, ist die zu untersuchende Probe in einem Mikrowellenresonator (meist rechteckige Hohlraumresonatoren) fixiert, dessen Geometrie seine Resonanzfrequenz bestimmt.

In der einfachsten Form der ESR-Spektroskopie, der continuous-wave ESR (CW ESR) wird über einen Mikrowellenhohlleiter eine stabile und frequenzgenaue Mikrowelle in den Resonator eingestrahlt. Das Magnetfeld wird dann schrittweise um ein definiertes Zentralfeld herum durchgefahren. Die Absorption wird detektiert und über eine Schottky-Diode von der Anregungsfrequenz getrennt. Typischerweise wird die Mikrowelle aus dem sog. X-band (etwa 9.4 GHz) eingestrahlt, was bei einem organischen Radikal zu einer Resonanz bei einem Magnetfeld von etwa 335 Millitesla führt.

Das so gemessene Spektrum ist also die Resonanzabsorption der Probensubstanz in Abhängigkeit der Änderung des Magnetfeldes. Parallel zum Hauptmagnetfeld sind noch Modulationsspulen in einem CW ESR Spektrometer angebracht. Sie haben Helmholtzgeometrie und werden mit einer definierten Radiofrequenz gespeist. Sie dienen zur messtechnischen Verstärkung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses des ESR-Signales durch Modulation mit einer Frequenz von typischerweise 100 kHz und führen dazu, dass de-facto die erste Ableitung des Absorptionssignals aufgenommen wird (s. Abb. 2b).

ESR-Spektroskopie an Nitroxid-Radikalen
Moderne CW ESR-Spektrometer sind im Vergleich zu anderen Methoden der Magnetresonanzspektroskopie heutzutage bereits als kostengünstige Tischgeräte erhältlich, wie sie exemplarisch in Abbildung 1 dargestellt sind. Diese Benchtop CW ESR-Spektrometer erlauben es, in einem breiten Temperaturbereich die ESR-Spektren von Radikalen aufzunehmen.

CW ESR-Spektroskopie kann immer eingesetzt werden, wenn Radikale (meist kohlenstoff- oder sauerstoffzentriert) einer gewissen Lebensdauer in Polymeren entstehen. Dies ist z. B. häufig der Fall, wenn Polymere zur Sterilisierung für Lebensmittel- oder Pharmaverpackungen mit harter Röntgen-/Gamma-Strahlung bestrahlt werden. Diese Radikale können dann analytisch nachgewiesen und die entstandenen Primär- oder Sekundärradikale durch Spektrensimulation oder einfachen Vergleich zugeordnet werden [1].

Seit den 1970er Jahren haben sich in der Erforschung von biologischen (Proteinen, Nukleinsäuren etc.) als auch synthetischen Makromolekülen chemisch stabile Nitroxidradikale wie Tempo ((2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yl)oxyl) und davon abgeleitete Strukturen (s. Abb. 2 a) als ungemein nützlich erwiesen. Neben der Rotationsdynamik (auf die wir hier nicht eingehen wollen) lässt sich der Informationsgehalt der ESR-Spektren von Nitroxidradikalen dabei wie folgt zusammenfassen [2]:

  • Der magnetische „Fingerabdruck" des Radikals ist gegeben durch den sogenannten isotropen „g-Wert", giso (bei schneller Rotation in Lösung). giso entspricht der chemischen Verschiebung in der NMR-Spektroskopie und hängt v. a. von der elektronischen Struktur der Radikale ab. Bei einem Nitroxid CW ESR-Spektrum bei isotroper Rotation in Lösung ergeben sich drei Linien, aus deren mittleren Nulldurchgang in der Mitte sich giso berechnen lässt (s. Abb. 2b).
  • Nitroxidradikale ergeben ein Drei-Linien-Spektrum aufgrund der magnetischen Wechselwirkung des Elektronenspins mit dem 14N-Kernspin der NO-Gruppe. Diese magnetische Wechselwirkung wird (isotrope) Hyperfeinwechselwirkung (aiso) genannt und lässt sich aus den Spektren als Abstand zwischen zwei Linien direkt ablesen (s. Abb. 2b). aiso hängt stark von der Umgebung der Sonde ab: je polarer die Umgebung, desto größer aiso und je unpolarer die Umgebung, desto kleiner ist aiso.

Wie in Abbildung 2b) angedeutet, ergänzen sich unterschiedliche giso und aiso so, dass man bei gleichzeitigem Vorhandensein von Nitroxidradikalen in polarer (z. B. Wasser) und unpolarer (z. B. in der Nähe eines Polymers) Umgebung, Spektren erhält, die als lineare Superposition Anteile von beiden „reinen" Spektren enthalten. Dieser Effekt ist bei der Linie bei höchstem Feld (eingerahmt in Abb. 2b) am deutlichsten sichtbar und man kann dies nun ausnutzen, um die temperaturabhängige Bildung unpolarer Polymertaschen von nanoskopischer Größe in thermoresponsiven Polymeren nachzuweisen. Mittels der nichtkovalenten Wechselwirkung von Tempo-Sonden mit diesen unpolaren Regionen kann man sogar auf die innere Struktur der nur nanometergroßen Aggregate Rückschlüsse ziehen.

ESR-Spektroskopie an Tempo in thermoresponsiven Polymeren
Die letzten Jahre haben eine Vielzahl an Forschungs- und Entwicklungsarbeiten an Polymeren gesehen, die eine untere kritische Lösungstemperatur (lower critical solution temperature, LCST) aufweisen, also in Wasser unterhalb einer kritischen Temperatur (Tc) gelöst sind und oberhalb von Tc ausfallen. Diese thermoresponsiven Polymere sind sowohl im akademischen als auch dem industriellen Sektor von großem Interesse, da sie hohes Potential für Anwendungen in den Bereichen des gerichteten Wirkstofftransports, des Tissue Engineerings, und auch als Trägermaterial für intelligente Sensorik bergen.

Diese faszinierende Klasse an Makromolekülen bildet während des Temperatur-induzierten Kollapses also beim Erwärmen der Lösung, räumliche nanoskopische Inhomogenitäten aus. Diese Inhomogenitäten im Bereich einiger Nanometer sind polymerreiche Aggregate, die eine unpolare, stärker hydrophobe Region als vollständig solvatisierte Polymerketten darstellen. Nanoskopische Inhomogenitäten bilden dabei keine separate Mikrophase, sondern sind rein lokale, nanoskopische Aggregate von Segmenten einzelner oder mehreren Polymerketten in einem ansonsten homogenen System (s. Abb. 3 c).

Die Ausbildung dieser unpolaren nanoskopischen Inhomogenitäten kann nun mittels CW ESR (an einem Benchtop Gerät) an Tempo in der Polymerlösung sehr genau verfolgt werden [4]. In Abbildung 3a ist ein Vertreter eines Triblock-Copolymers der allgemeinen Zusammensetzung Poly(ethylenoxid)-Poly(propylenoxid)-Poly(ethylonoxid) (PEO-PPO-PEO, Handelsname Pluronic) gezeigt. In Pluronics macht eine einzige zusätzliche Methylgruppe pro PPO (im Vergleich zu PEO) Monomereinheit den PPO-Block deutlich hydrophober und thermoresponsiv. Pluronics können nun durch Variation der Temperatur und Konzentration, der absoluten Blocklängen und der relativen PEO und PPO-Anteile, eine faszinierende Vielfalt komplexer Strukturen in Wasser ausbilden.

In Abbildung 3b taucht mit steigender Temperatur (von blau nach rot wird in den Spektren in der Abbildung 3b Tc überschritten), aber bereits deutlich unterhalb der kritischen Temperatur neben der spektralen Signatur von Tempo in polarer / wässeriger Umgebung (Spezies „B" in Abb. 2a und 3b) ebenfalls die Signatur von Tempo in deutlich unpolarer Umgebung auf, die von Tempo in hydrophoben Polymeraggregaten stammen muss (Spezies „A" in Abb 2a und 3b). Aus der temperaturabhängigen Entwicklung der CW ESR Spektren, v. a. aus einer einfachen Größe wie dem aus dem Spektrum ablesbaren Verhältnis von Spezies „A" zu „Spezies „B" lässt sich für dieses Pluronic (P84, 60 % PPO Anteil) ein Bild entwerfen, wie es in Abbildung 3c schematisch dargestellt ist.

Deutlich unterhalb von Tc hat man vollständig solvatisierte Pluronic-Ketten vorliegen, während bei Erhöhung der Temperatur über Tc sich Mizellen bilden, die PPO-Blöcke im Kern und PEO-Blöcke in der Corona tragen. Spektroskopisch lässt sich aber klar zeigen, dass bereits unterhalb des makroskopisch sichtbaren thermischen Überganges nanoskopische Polymeraggregate entstehen, man also Tempo-Spezies „A" detektiert. Diese Aggregate „fangen" die Tempo-Sonden (die einen Verteilungskoeffizienten haben, der sie sich bevorzugt in wasserarmen Regionen aufhalten lässt) ein, die auf der ESR-Zeitskala auch nicht in die wasserexponierte Region diffundieren können (und umgekehrt). Bei Pluronics mit niedrigem (< 30 %) PPO Anteil kann man spektroskopisch sogar entschlüsseln, dass Tempo-Sonden zwischen den beiden Regionen "A" und "B" hin- und her-diffundieren können. Obwohl Pluronic-Triblock-Copolymere seit Jahrzehnten mit einer Vielzahl physikalischer Methoden, u. a. auch mit CW ESR-Spektroskopie untersucht wurden, konnten erst einfache CW ESR Temperaturreihen mit der amphiphilen Sonde Tempo die klar auftauchenden nanoskopischen Inhomogenitäten detektieren.

Anwendung auf weitere Systeme
In einer Vielzahl anderer thermoresponsiver Polymere konnten ähnliche Effekte beobachtet werden, die sich sehr stark auf die Wechselwirkung dieser Polymere mit amphiphilen Molekülen wie Tempo auswirken [5-7]. Das Verständnis dieser Effekte ist von großer Bedeutung wenn man die Nutzung v. a. im Bereich des Wirkstofftransportes und weitere synthetischen Entwicklungen bedenkt. Aufgrund der Verfügbarkeit einfach zu bedienender Benchtop CW ESR-Spektrometer,  der einfachen Versuchsreihen mit der einfachen Beimischung von Tempo-Sonden zu Polymerlösungen, sowie der simplen Spektrenauswertung (Verhältnis spektrale Komponente „A" zu „B") kann man die CW ESR-Spektroskopie an thermoresponsiven Polymeren als beinahe analytisch zu verwendende physikalische Messmethode bezeichnen. Derzeit wird am Institut daran gearbeitet, diese Methode in weiteren Systemen zu testen und das Bild der möglichen nanoskopischen Inhomogenitäten immer stärker zu erweitern und zu verfeinern.

Literatur
[1] Gerson F. und Huber W.: Electron Spin Resonance Spectroscopy for Organic Radicals, Wiley-VCh, Weinheim, 2001
[2] Hinderberger D.: Top. Curr. Chem. 321, 67-89 (2012)
[3] Wunderlich B.: Thermochimica Acta 403, 1 (2003)
[4] Kurzbach D. et al.: ChemPhysChem 12, 3566 (2011)
[5] Junk M. et al.: Small 4, 1485-1493 (2008)
[6] Junk M. et al.: Angew. Chem. 122, 5818-5823 (2010)
[7] Kurzbach D. et al.: Macromolecules 45, 7535-7548 (2012)

 

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