Es sind die kleinen Dinge des Lebens - Metabolic Profiling

  • Abb. 2: GC-MS, A: Chromatogramm Standard und Pflanzenextrakt;  B: Massenspektrum (Butandeionic-acid); C: Derivatisirung im Liner (Qualitätskontrolle); D: Verunreinigter Liner und Septum nach 10 Injektionen; E: Derivatisierungsreaktion mit MSTFAAbb. 2: GC-MS, A: Chromatogramm Standard und Pflanzenextrakt; B: Massenspektrum (Butandeionic-acid); C: Derivatisirung im Liner (Qualitätskontrolle); D: Verunreinigter Liner und Septum nach 10 Injektionen; E: Derivatisierungsreaktion mit MSTFA
  • Abb. 2: GC-MS, A: Chromatogramm Standard und Pflanzenextrakt;  B: Massenspektrum (Butandeionic-acid); C: Derivatisirung im Liner (Qualitätskontrolle); D: Verunreinigter Liner und Septum nach 10 Injektionen; E: Derivatisierungsreaktion mit MSTFA
  • Abb. 3: A: Chronogramm Bambusproben (24 Proben überlagert); B: PCA der Proben mit Gruppierung; C: Identifikation eines möglichen Markers mittels MS/MS Spektrum und Vergleich mit Referenzspektrum

Es sind oftmals die kleinen Dinge, die das Leben ausmachen. Wenn wir in diesem Kontext von kleinen Dingen sprechen, meinen wir damit kleine organische Moleküle mit Molekularmassen bis ca. 1000 Dalton. Diese repräsentieren das Metabolom, oder die Stoffwechselprodukte eines jeden Organismus vom Bakterium über Pflanzen bis hin zu Tieren. Stoffwechselprodukte, in ihrem ständigen Wechselspiel zwischen Organismus und Umwelt, als Spiegel des Genoms und des Proteoms, können uns viel über den aktuellen Zustand eines Organismus verraten [1].

Ob es nun darum geht festzustellen, wie ein Stoffwechselweg funktioniert, ob eine signifikante Störung vorliegt oder ob ein gewünschtes Stoffwechselprodukt bei bestimmten Bedingungen hergestellt wird, es geht letztlich um die Messung von mehrheitlich gut bekannten Stoffgruppen. Dabei spricht man von einer Gesamtheit von einigen tausend relevanten Verbindungen, vom Alkohol über das Lipid bis hin zum Zucker. Klassisch werden einzelne Metaboliten mit einer Vielzahl von Methoden gemessen, die zum Einmaleins jedes Analytikers gehören [2,3]. Bei vielen Fragestellungen liegt der Fokus nicht auf einzelnen bekannten Metaboliten („targeted metabolic profiling“) sondern auf einem ganzen Metaboliten-Panel. Als Beispiele aus unserm Labor seien Projekte wie die Messung von Stoffwechselprodukten aus Holunder-Extrakten, die Unterscheidung von Bambusarten [4], die Identifikation von potentiellen Krebsmarkern aus kultivierten Krebszellen oder der Messung des Einflusses von Phytopharmazeutica auf die Metaboliten im Blut genannt.In diesen Fällen ist ein Profiling notwendig, welches unspezifisch möglichst viele Metaboliten erfasst („non-targeted metabolic profiling“). Analytisch am besten dafür geeignet ist die Massenspektrometrie aufgrund ihrer Empfindlichkeit und Selektivität. Für die Realisierung dieser Projekte wurde an einer universellen Metabolomics-Plattform gearbeitet, um möglichst viele verschiedene Metaboliten messen zu können ohne das „Rad“ für jedes Projekt neu erfinden zu müssen.

Dabei wurde hauptsächlich auf zwei Standbeine gesetzt: die GC-MS und die LC-QTOF-MS/MS. Beide Techniken können komplementär eingesetzt und auf die jeweils spezifische Fragestellung angepasst werden. Zu diesem Zweck wurde eine Methode nach O. Fiehn [5] adaptiert, die einen etablierten Arbeitsablauf darstellt (Abb. 1).

Proben Sammeln

Ausgehend von der Fragestellung müssen ausreichend Proben mit weitreichender Vergleichbarkeit erfasst werden. Dies ist nicht immer einfach, da z.B. oft bei vielen Krankheiten nicht viele Patienten zur Verfügung stehen und die Proben an verschieden Orten zu unterschiedlichen Zeiten erfasst werden müssen. Mindestens jeweils 10 Proben aus Effekt- und Kontrollgruppe sind allerdings notwendig, wobei technische Replikate nicht mitgerechnet werden dürfen. Zusätzlich ist die Lagerung vom Sammeln bis zum Messen kritisch, ebenso der Transport und die Wahl der Probengefässe. Bei der nachfolgenden Analyse ist ausserdem darauf zu achten, dass Proben aller Gruppen in einer zufälligen Reihenfolge verarbeitet und gemessen werden, um Batch Effekte zu vermeiden.

Probenvorbereitung - Tipps und Tricks

Bei der Probenvorbereitung geht es um das Gleichgewicht von minimalem Verlust und Robustheit der Methode. Generell hängt die Vorgehensweise von der Matrix ab, wobei die Vergleichbarkeit der Proben erhalten werden muss. Die Fiehn-Methode (Abb. 1) verwendet eine standardisierte Extraktion gefolgt von einem Trocknungsschritt. Anschliessend erfolgt entweder die direkte Analyse mittels LC-QTOF-MS/MS oder, nach erfolgter Derivatisierung, die Analyse mittels GC-MS. Allfällige zusätzliche Reinigungsschritte können jederzeit eingeschaltet werden.

Für Pflanzenextrakte wird beispielsweise 30 µL Pflanzenextrakt mit 1000 µL eiskaltem Acetonitril/Isopropanol/Wasser (3/3/2 v/v/v) gemischt. Die Lösungsmittelmischung wird vorher für eine Stunde in einem Eisbad gekühlt und im Ultraschallbad entgast (entgasen mithilfe von Helium ist noch besser), um gelösten Sauerstoff zu entfernen und Oxidationen in der Probe zu vermeiden. Nach längerem Schütteln und Zentrifugieren wird jeweils 450 µL des flüssigen Überstands in zwei neue Gefäße transferiert. Dadurch werden bereits Teile der unerwünschten Salze und Proteine entfernt.

Die Lösungen werden anschliessend in einer Vakuumzentrifuge bis zur Trockene eingedampft. Dies geschieht am besten stufenweise. Zusätzlich ist es auch möglich den Gefäßdeckel mit einer Metallnadel zu durchstechen (Durchmesser ca. 0.9 mm) und die Vakuumzentrifugation mit geschlossenem Deckel durchzuführen. Dies reduziert den Verlust von Verbindungen mit relativ geringer Flüchtigkeit. Generell ist dieser Schritt der Probenvorbereitung mit den grössten Probenverlusten behaftet. Vor allem das Eindampfen des Wasserrückstands am Ende des Prozesses ist wenig Probenschonend. Ein manuelles Eindampfen mit Stickstoff bei Raumtemperatur liefert im Vergleich dazu eine bessere Ausbeute hinsichtlich der Anzahl der gefundenen Verbindungen. Es bedeutet aber auch einen wesentlich höheren Zeitaufwand von mehreren Stunden. Dieser kritische Schritt hängt vor allem von den untersuchten Analyten, sowie den vorhandenen Laboreinrichtungen ab. Die getrockneten Proben werden in 500 µL Acetonitril/Wasser 1:1 aufgenommen, geschüttelt und zentrifugiert. Der Überstand von 400 µL wird in ein neues Eppendorf-Tube transferiert und kann nun entweder direkt für die HPLC-QTOF-MS/MS Analyse verwendet werden, oder für die GC-MS erneut in der Vakuumzentrifuge zwei Stunden bis zur Trockene eingedampft werden.

GC-MS Derivatisierung der Proben

Die Derivatisierung ist notwendig, um alle Metaboliten GC-gängig zu machen und wirkt sich auch positiv auf die Peakform aus (Abb. 2C). Bevor die Derivatisierung mittels MSTFA durchgeführt werden kann, muss die Probe komplett getrocknet werden. Restwasser führt zu einer exothermen Hydrolyse, was wiederum zu thermischer Zersetzung der Probe und unvollständiger Derivatisierung führen kann.

GC-MS Robustheit und Systemtest

Die Analyse von biologischen Probenextrakten mit hohem Matrixgehalt führt bereits nach kurzer Zeit zu einer systematischen GC-MS Verunreinigung. Die Injektionsnadel sollte daher vor und nach jeder Injektion dreimal mit Ethylacetat gespült werden. Der Liner muss dennoch nach ca. 10 Injektionen gewechselt werden, da es sonst zu Verschleppungen kommen kann. Es sind daher ständige Tests notwendig, um die korrekte Funktion des Liners zu überprüfen. Eine Möglichkeit zur Liner-Kontrolle ist die Injektion eines underivatisierten Standards. Kann im GC-MS dennoch ein Signal des derivatisierten Standards nachgewiesen werden, muss der Liner gewechselt werden (Abb. 2D).

LC-QTOF-MS/MS

Im Vergleich zur GC-MS liefert die LC-MS komplementäre Daten. Im Allgemeinen hat man bei der LC mehr Spielraum in Bezug auf die Trennung nach chemischen Eigenschaften. Dies macht es aber schwierig eine standardisierte Methode anzuwenden. Im Sinne der universellen Vergleichbarkeit verwenden wir oft Umkehrphasen (z.B C8 oder C18) mit einem generischen Gradienten (z.B. Wasser/Acetonitril mit 0.1 % Ameisensäure innerhalb 40 min von 95:5 auf 0:100) Es empfiehlt sich dabei die Reihenfolge der Injektionen zufällig zu gestalten (vermeiden von Batch Prozessen).

Interpretation der Daten

Die Interpretation der Daten stellt den letzten und wesentlichen Teil der Arbeit im Metabolic Profiling dar. Zwar gibt es zahlreiche Softwarepakete, welche die Arbeit erheblich erleichtern, dennoch ist eine ausgebildete Person notwendig, die in Kleinarbeit die Daten durchgeht, statistisch auswertet und interpretiert. Sowohl bei der GC-MS als auch bei der LC-QTOF-MS/MS erhalten wir Chromatogramme mit einer Vielzahl an Signalen (Abb. 2A und B). Im generellen Ablauf werden aus dem Chromatogramm in einem ersten Schritt jeweils die signifikanten Peaks noch ohne eindeutige Identifikation statistisch ausgewertet. Man erhält dann z.B. aus der Hauptkomponentenanalyse (Principal Component Analyse, PCA) Signale, die nur bei der Effektgruppe verändert sind (Abb. 3). Diese Signale werden im Anschluss identifiziert. Bei der GC-MS erfolgt dies mittels Auswertung der EI (electron impact) Spektren unter Einbezug der Retentionszeiten mit Hilfe von Bibliotheken (z. B. NIST). Dabei muss beachtet werden, dass durch die Derivatisierung alle Hydroxygruppen durch Trimethylsilylgruppen ersetzt wurden. Bei der HPLC-QTOF-MS/MS ist es die signalabhängige Fragmentierung mittels CID (Collision-Induced Dissociation), die uns hilft Signale zu interpretieren. Trotzt diverser Bibliotheken (METLIN, HMDB) ist dieser Prozess zur Substanzcharakterisierung immer noch Handarbeit und damit sehr zeitaufwändig.

Fazit - Herausforderungen

Nach der Probenerhebung muss vor allem die Probenaufarbeitung standardisiert werden. Die Eindampfschritte sind sehr kritisch, da dabei Verbindungen verloren gehen können. Bei der Analyse muss darauf geachtet werden, dass die Systeme ausreichend validiert (sauber und kalibriert) wurden. Der finale Engpass ist schliesslich die Interpretation der Daten. Einerseits fallen gerade bei der LC-QTOF-MS/MS grössere Datenmengen an (>1 GByte/Probe), andererseits fehlt es oft an der Anzahl statistisch vergleichbaren Proben. Diese Herausforderung kann in Zukunft nur durch die Verwendung von standardisierten Methoden sowie der Analyse von vielen, unter vergleichbaren Bedingungen erfassten und aufbewahrten Proben, bewältigt werden. Gefundene Marker müssen schlussendlich auch unter Verwendung von komplementären Methoden und in unabhängigen Studien validiert werden.

Literatur
[1] O. Fiehn: Plant Molecular Biology 48, 155–171 (2002)
[2] P. Yin et al.: Journal of Chromatography A 1374, 1–13 (2014)
[3] Kind et al.: PLoS ONE 4; 5 e5440 (2009)
[4] T. Hettich und G. Schlotterbeck, Chimia 69, 294–295 (2015)
[5] O. Fiehn et al.: Metabolomics 5, 435–458 (2009)

Autoren
Ch. Berchtold, F. Senner, T. Hettich, G. Schlotterbeck

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