Grundlagen der Chromatographie

Selektivität versus Effizienz

  • Abb. 1: Resultierende chromatographische Auflösung R in Abhängigkeit von der Selektivität α, der Bodenzahl N und des Retentionsfaktors k. Zur Berechnung der jeweiligen Größen wurden folgende Werte angenommen: α = 1,03, N = 5000 und k = 3. Abb. 1: Resultierende chromatographische Auflösung R in Abhängigkeit von der Selektivität α, der Bodenzahl N und des Retentionsfaktors k. Zur Berechnung der jeweiligen Größen wurden folgende Werte angenommen: α = 1,03, N = 5000 und k = 3.
  • Abb. 1: Resultierende chromatographische Auflösung R in Abhängigkeit von der Selektivität α, der Bodenzahl N und des Retentionsfaktors k. Zur Berechnung der jeweiligen Größen wurden folgende Werte angenommen: α = 1,03, N = 5000 und k = 3.
  • Abb. 2: Abhängigkeit zwischen  Trennsäuleninnendurchmesser und der  linearen Fließgeschwindigkeit (linke y-Achse) und der absoluten Flussrate (rechte y-Achse).
  • Abb. 3: Resultierende van-Deemter Kurven für 50 x 0,3 mm Trennsäulen gepackt mit 1,9 µm und 3,0 µm vollporösen sowie 2,7 µm teilporösen Partikeln bei 30 °C. Die monolithische Säule wies eine Dimension von 150 x 0,2 mm auf. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung von John Wiley & Sons, Inc.
Thorsten Teutenberg1, Terence Hetzel1, Denise Loeker1, Juri Leonhardt1
 
Wenn es darum geht, ein chromatographisches Trennproblem zu lösen, können mehrere Strategien angewendet werden. Dabei gibt die sog. Purnell-Gleichung, die häufig auch als „Master-Gleichung“ der Chromatographie bezeichnet wird, die Einflussparameter für die zielgerichtete Optimierung der Auflösung an [1, 2]:
 
 
Anhand dieser Gleichung ist ersichtlich, dass drei Ansatzpunkte existieren, um eine Trennung mit ausreichender Auflösung R zu bewirken, nämlich die Erhöhung der Selektivität α, der Effizienz anhand der Bodenzahl N und der Retention über den Retentionsfaktor k.

Als Zielgröße wird dabei i. d. R. eine Mindestauflösung von 1,5 angestrebt, sodass eine Basislinientrennung resultiert. In Abbildung 1 ist die Auflösung gegen die drei Variablen α, k und N aufgetragen.

 
Retentionsfaktor
 
Um eine Trennung zu erhalten, ist eine ausreichende Retention erforderlich. Allerdings führen Retentionsfaktoren > 5 nicht mehr zu einer signifikanten Erhöhung der Auflösung. Vor diesem Hintergrund sollte die Elutionsstärke der mobilen Phase so eingestellt werden, dass ein Retentionsfaktor zwischen 2 und maximal 10 resultiert. Retentionsfaktoren > 10 führen lediglich zur Erhöhung der Analysenzeit, und ein nennenswerter Einfluss auf die Auflösung ist nicht mehr zu beobachten. Das folgende Zahlenbeispiel soll verdeutlichen, dass der Retentionsfaktor als dimensionslose Größe nichts über die tatsächliche Analysenzeit aussagt und dass trotz hoher Retentionsfaktoren kurze Analysenzeiten möglich sind. Beträgt die Durchflusszeit (t0) eine Minute und der Retentionsfaktor 10, so bedeutet dies eine Retentionszeit (tR) der Komponenten von 11 Minuten, wie anhand folgender Gleichung berechnet werden kann:
 
 
Erhöht sich der Retentionsfaktor auf z. B. 50, ergibt sich eine Retentionszeit von 51 Minuten, wenn die Durchflusszeit nicht verändert wird. Gelingt es jedoch, die Durchflusszeit zu minimieren, auf z. B. sechs Sekunden, so würde selbst bei einem Retentionsfaktor von 50 nur eine Retentionszeit von 5,1 Minuten resultieren.
 
Flussrate
 
Die Minimierung der Durchflusszeit kann auf zwei Arten erfolgen. Wird der Innendurchmesser der Trennsäule konstant gehalten, muss die absolute Flussrate erhöht werden, um auch die lineare Fließgeschwindigkeit (u0) der mobilen Phase zu erhöhen, die gemäß folgender Gleichung berechnet werden kann:
 
 
Bei gegebener konstanter Flussrate kann aber auch der Innendurchmesser der Trennsäule verkleinert werden, sodass eine höhere lineare Fließgeschwindigkeit erhalten wird. Dies ist übrigens ein großer Vorteil der Mikro-LC. Aufgrund der Kombination eines geringen Innendurchmessers für Mikro-LC-Säulen von 300 µm und relativ niedrigen absoluten Flussraten im Bereich von 40 µL min-1 können sehr hohe lineare Fließgeschwindigkeiten erzielt werden, wie anhand der Abbildung 2 deutlich wird. Aufgetragen ist der Innendurchmesser der Trennsäule gegen die lineare Fließgeschwindigkeit (linke y-Achse) bei gegebener Flussrate bzw. gegen die absolute Flussrate (rechte y-Achse) bei gegebener linearer Fließgeschwindigkeit. Anhand der aufgetragenen Daten kann abgelesen werden, dass die lineare Fließgeschwindigkeit bei einer konstanten absoluten Flussrate von 40 µL min-1 von 0,058 mm s-1 auf 13,6 mm s-1 steigt, wenn der Innendurchmesser von 4,6 mm auf 300 µm reduziert wird. Ausgehend von einer konstanten linearen Fließgeschwindigkeit von 13,6 mm s-1 erhöht sich die absolute Flussrate von 40 µL min-1 bis auf 9,4 mL min-1, wenn der Innendurchmesser von 300 µm auf 4,6 mm erhöht wird. Um also unter Verwendung klassischer Säulenformate dieselbe Analysenzeit im Vergleich zu Mikro-LC-Anwendungen zu erreichen, muss die absolute Flussrate drastisch erhöht werden. Dies schlägt sich in einem sehr hohen Verbrauch an teuren und toxischen Lösungsmitteln nieder.
 
Es stellt sich nun die Frage, mit welchem Verlust an Trennleistung zu rechnen ist, wenn solch hohe lineare Fließgeschwindigkeiten eingestellt werden. Die Daten in Abbildung 3 geben hierüber Aufschluss. Aufgetragen ist die Bodenhöhe H gegen die lineare Fließgeschwindigkeit u0 für verschiedene stationäre Phasen. 
 
Es ist klar zu erkennen, dass bei Verwendung von sub 2 µm Partikeln der Anstieg im C-Term Bereich der van-Deemter Kurve sehr gering bzw. zu vernachlässigen ist, wenn entweder vollporöse Partikel mit einem Durchmesser von 1,9 µm bzw. ein Core-Shell-Material mit einem Durchmesser von 2,7 µm verwendet wird. Im Gegensatz dazu führt der steilere Anstieg im C-Term Bereich für die monolithische Phase sowie vollporöse Partikel mit einem Durchmesser von 3 µm zu einer Erhöhung der theoretischen Bodenhöhe und somit auch zu einem stärkeren Verlust der Bodenzahl N. Für sehr schnelle Analysen sollte deshalb immer auf sub 2 µm Partikel zurückgegriffen werden. Anhand der Master-Gleichung für die Auflösung wird deutlich, dass die Erhöhung der Trennstufenzahl natürlich auch zu einer Verbesserung der Auflösung führt, allerdings steigt die Auflösung nur proportional zur Wurzel aus N. Eine Verdopplung der Trennstufenzahl schlägt sich demzufolge nur mit einem Faktor von 1,4 nieder. Dies bedeutet, dass für eine zielgerichtete Optimierung der Auflösung für ein einzelnes kritisches Peakpaar die Selektivität des Phasensystems als Schlüsselparameter angesehen werden kann. Relativ kleine Änderungen der α-Werte führen, wie in Abbildung 1 dargestellt, zu großen Änderungen der Auflösung.
 
Selektivität
 
Die Selektivität ist definiert als Quotient aus dem Retentionsfaktor der später eluierenden Komponente zum Retentionsfaktor der früher eluierenden Komponente:
 
 
Eluiert eine Komponente bei einem k1-Wert von 2, die zweite Komponente bei einem k2-Wert von 12, ergibt sich rein rechnerisch ein α-Wert von 6. Dieselbe Differenz der k-Werte führt bei einem k2-Wert von 50 und einem k1-Wert von 40 nur zu einem α-Wert von 1,25. Anhand dieses Beispiels wird wiederum eindrucksvoll deutlich, dass hohe k-Werte nicht von Vorteil sind, wenn es darum geht, die Selektivität und damit Auflösung eines einzelnen kritischen Peakpaares zu erhöhen.
 
Kritisch anzumerken ist, dass das hier vorgestellte Konzept nur für isokratische Trennungen gültig ist. Darüber hinaus wird nur ein einzelnes Peakpaar betrachtet, dessen Auftrennung es zu optimieren gilt. Die Trennung eines Zwei-Komponenten-Gemisches kann jedoch nicht als komplex bezeichnet werden. Im Bereich der Life Sciences besteht die Herausforderung heute darin, Gemische aufzutrennen, die aus über 10.000 Einzelverbindungen bestehen. Bei einer derart großen Anzahl an Verbindungen sind Koelutionen somit unvermeidbar. Dass selbst eine vollständige Basislinientrennung von „nur“ 50 Verbindungen in einem chromatographischen Lauf eine große Herausforderung darstellt, verdeutlicht die folgende Beispielrechnung, die auf Überlegungen von Calvin C. Giddings aus dem Jahre 1983 zurückgeht [3]. Giddings stellte sich die Frage, wie groß die Wahrscheinlichkeit ist, ein Gemisch aus m-Komponenten auf einer HPLC-Säule mit gegebener Peakkapazität vollständig aufzutrennen. Bestünde die Probe also aus 50 Substanzen und soll die Trennung auf einer Säule mit einer Peakkapazität von 100 durchgeführt werden, so würden 32 von 50 Verbindungen koeluieren. Nur 18 Peaks bestünden tatsächlich aus einer Verbindung. Hieraus leitet sich die Strategie ab, dass bei komplexen Proben die Effizienz anstelle der Selektivität zu maximieren ist. Aufgrund der großen Unterschiede in der Polarität der Verbindungen scheidet die isokratische Arbeitsweise aus. Anstelle der Trennstufenzahl N für isokratische Trennungen muss nun die Peakkapazität nc für Gradiententrennungen betrachtet werden. Im nächsten Beitrag werden wir deshalb die Strategie erläutern, um anhand von ein- und zweidimensionalen Trennungen die Peakkapazität zu maximieren.
 
Zugehörigkeit
1Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V., IUTA, Bliersheimer Str. 58-60, 47229 Duisburg, Deutschland
 
Kontakt
Thorsten Teutenberg
Institut für Energie- und Umwelttechnik e.V.
Duisburg
adlichrom@iuta.de
 
Mehr zur Fortschrittlichen Chromatographie: http://www.git-labor.de/fortschrittliche-chromatographie
 
Chemgapedia-Lerneinheit(en) zur Chromatographie: http://www.chemgapedia.de/vsengine/topics/de/Chemie/Analytische_00032Chemie/Chromatographie/index.html
 

Haben Sie Fragen zur Anwendung und Technik im Bereich Mikro-LC und 2D-LC? Fragen Sie die Experten vom IUTA: adlichrom@iuta.de

Referenzen:

[1] J.H. Purnell, Comparison of efficiency and separating power of packed and capillary gas chromatographic columns, Nature, 184 (1959) 2009-2009. doi:10.1038/1842009a0

[2] J.H. Purnell, The correlation of separating power and efficiency of gas-chromatographic columns, Journal of the Chemical Society, (1960) 1268-1274. DOI:10.1039/JR960000126

[3] J.M. Davis, J.C. Giddings, Statistical theory of component overlap in multicomponent chromatograms, Anal. Chem., 55 (1983) 418-424. DOI:10.1021/ac00254a003

 

Kontaktieren

Microsite Fortschrittliche Chromatographie


Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.