HPLC-Chromatographiesäulen

Coreshell- oder sub-2-μm-Phasen für die LC-MS-Peptidanalytik

  • Tab. 1: Auswirkung der Belastung mit Ameisensäure-haltigem Eluenten.Tab. 1: Auswirkung der Belastung mit Ameisensäure-haltigem Eluenten.
  • Tab. 1: Auswirkung der Belastung mit Ameisensäure-haltigem Eluenten.
  • Tab. 2.: Peptid-Trennleistung der verschiedenen Säulen.
  • Abb. 1: Vergleich von Trennstufenhöhe und Tailing.
  • Abb. 2: Vergleich der Neue-Parameter (Mittelwert von je 2 Säulen).
  • Abb3.PNG
  • Tab. 3: Einfluss der Trenntemperatur bei Peptidelution von der Ascentis Express-Säule.
  • Tab. 4: Einfluss der Flussrate bei Peptidelution von der Poroshell-Säule.

Die Reversed-Phase HPLC-MS nach tryptischem Verdau ist in der Proteinanalytik zweifellos das Verfahren der Wahl. Hierbei ist die HPLC-Trennleistung der gravierende Schwachpunkt, wenn z.B. mehrere tausend Peptide einer biologischen Probe untersucht (shot-gun-Methode) oder Punktmutationen in einem Protein (z. B. Ile-Leu-Austausch) differenziert werden sollen.

Seit einigen Jahren propagieren viele Hersteller Säulen mit Partikelgrößen kleiner 2 μm. Die Verbesserung der Trennleistung geht jedoch einher mit gravierenden, technischen und applikativen Problemen (Druckabfall, Totvolumina, Eingangsfilter), weshalb insbesondere in einer robusten, validierten LC-MS-Analytik Alternativen gefragt sind.

Hier können Coreshell-Partikel eine Option sein, bei denen auf einem unporösen Kern eine sorptionsaktive, poröse Schicht aufgebracht ist. Durch die reduzierten Diffusionseffekte bieten diese Phasen eine vergleichbare Trennleistung bei größerem Teilchendurchmesser (dp ~3 μm) und deutlich reduziertem Druckabfall (Δp < 300 bar) [1,2]. Da zu Beginn des Jahres ein weiterer, etablierter Hersteller solche Säulen anbietet, erschien eine Bewertung dieser Phasen insbesondere für die 2D-LC-MS-Peptidanalytik angebracht. In den vorliegenden Untersuchungen wurden die Coreshell-Phasen der bekanntesten Anbieter und eine total poröse sub-2-μm-Phase (Zorbax Rapid Resolution HT) evaluiert.

Säulen-Charakterisierung
Es wurden folgende Säulen eingesetzt:

  • Ascentis Express Peptide ES-C18, 2,6 μm (Supelco)
  • Kinetex XB-C18, 2,6 μm (Phenomenex)
  • Poroshell 120 SB-C18, 2,6 μm (Agilent)
  • Zorbax SB-C18 Rapid Resolution HT, 1,8 μm (Agilent). 

Es liegen unterschiedliche Porengrößen vor, alle Säulen haben die Dimensionen 100 x 2,1 mm.

Die Charakterisierung erfolgte nach Neue [3], bei dem aus der Elution von 7 Komponenten Trennstufenhöhe, Tailing, Silanol-Aktivität, Hydrophobizität, Hydrobe bzw. Hydrophile Selektivität ermittelt werden. Es muss nicht weiter ausgeführt werden, dass hierbei größte Anstrengungen unternommen wurden, um Totvolumina zu minimieren.

Chromatographische Kennzahlen
Abbildung 1 vergleicht Trennstufenhöhe und Tailing der 4 Phasen. Die Asymmetrie wurde mittels USP-Tailing aus Amitryptilin bestimmt, die Trennstufenhöhe h wurde vom Naphthalin-Peak aus der Peakbasisbreite (Tangentenmethode) ermittelt (Anhang 3: Gleichungen). Manche Hersteller verwenden die Peakbreite in halber Höhe und erhalten so deutlich kleinere h-Werte, dies entspricht aber nicht der etablierten Vorgehensweise. Als Näherung für die Trennstufenhöhe gilt: h ~ 3 dp + 6 / u + 0,05 dp 2u mit u: lineare Flussgeschwindigkeit [mm/s], dp: Teilchengröße [μm] Daraus folgt: h ~ 7 μm bei dp = 1,8 μm (u ~ 5 mm/s) bzw. h ~ 11 μm für dp = 2,6 μm (u ~ 3 mm/s)

Die ermittelten Resultate entsprechen den Erwartungen, lediglich die Ascentis Express- Säule fällt etwas ab (sie zeigt auch den niedrigsten Druckabfall).

Beim Tailing-Vergleich zeigt die Kinetex- Säule ein etwas ungünstigeres Verhalten.

Abbildung 2 fasst die weiteren Neue-Parameter in einem Diagramm zusammen und gibt exemplarisch das Chromatogramm der Kinetex- Säule wieder.

Während die hydrophobe Selektivität bei allen Phasen vergleichbar ist, unterscheiden sich diese in den anderen Parametern deutlich. Hervorzuheben ist, dass Agilent gleiche Bindung der C-Ketten mit vergleichbaren Eigenschaften seiner beiden Phasen propagiert. Die Silanol-Aktivität (verbliebene OH-Gruppen) korreliert nicht mit dem gemessenen Tailing.

Belastungs-Untersuchung
Die Peptid-Elution erfolgt meist mit Zusatz von 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) zum Eluenten. Während früher die Phasen hierbei noch eine deutliche Instabilität durch Hydrolyse der C-Ketten zeigten [4], haben die Hersteller dieses Problem mit den aktuellen Phasen gut gelöst. Alternativ wird heutzutage aber oft ein Zusatz von Ameisensäure (FA) verwendet, da dies in der Electrospray-MS-Kopplung höhere Ionenintensitäten zeigt. Ameisensäure hat einen deutlich aggressiveren Einfluss auf die C-Bindung, daher wurde über die Säulen für 2 Wochen ein Eluent mit 25 % aq. CH3CN + 0,1 % FA bei einem Fluss von 0,25 ml/min im Kreislauf gefördert (Raumtemperatur).

Tabelle 1 gibt die prozentualen Veränderungen von Retention, Trennleistung und Asymmetrie nach Belastung wieder.

Bemerkenswert ist, dass durch die Belastung die Trennstufenhöhe von RRHT1.8 und Ascentis Express besser wird, auch die Asymmetrie der Poroshell-Phase wird günstiger.

Die deutliche Verringerung der Retention (tR) von Naphthalin und noch drastischer beim Amitryptilin zeigt eine massive Reduktion des CAnteils über 2 Wochen. Dies ist für eine robuste, stabile Proteom-Analytik unzureichend.

Peptid-Elution
Zur Bewertung der Säulen hinsichtlich Peptid- Mapping wurden 25 definierte Peptide mit unterschiedlichen Molmassen, Hydrophobizitäten und Isoelektrischen Punkten (Anhang 1: Peptidliste) zuerst als Einzelsubstanzen in einer Doppelbestimmung im Gradienten eluiert (Anhang 2: Apparative Bedingungen). Danach wurden Peptidmischungen von 8 – 9 Peptiden getrennt und ausgewertet.

Trennleistung und Selektivität
Aus der Doppelbestimmung folgte eine Verschleppung, wenn die Peakfläche des 2. Laufs größer als beim ersten Chromatogramm war. Die Asymmetrie wurde nach USP-Methode und die Peakbasisbreite nach der Tangentenmethode ermittelt. Die Peakkapazität ([5] Anhang 3) gibt an, wie viele Komponenten im Gradienten getrennt werden könnten. Tabelle 2 listet die Resultate auf.

Die Verschleppung liegt in der Regel unter 5 % und ist anders als bei Protein-RP-Trennungen unkritisch [6]. Lediglich die Poroshell-Säule fällt hier etwas ab. Die Gesamtfläche aller Peptidpeaks als Maß für die Wiederfindung ist bei allen Säulen nahezu identisch (Werte nicht angegeben).

Peakbreite und Peakkapazität zeigen, dass die Coreshell-Säulen gegenüber der 1,8 μm- Säule nicht signifikant schlechter abschneiden. Der Einsatz von sub-2-μm-Phasen mit hohem Druckabfall ist daher in der Peptid-Gradientelution nicht zwingend notwendig.

Die Selektivität wird bewertet in Form der chromatographischen Auflösung R für die Trennung zweier Peptide, die sich nur durch Austausch einer Aminosäure unterscheiden.

Insbesondere wurde hier der Tausch von Glycin-Alanin (A/G), Isoleucin-Leucin (I / L) und Asparaginsäure-Glutaminsäure (D/E) betrachtet. Die Auflösung der entsprechenden Peptidpaare ist in Abbildung 3 als A/G-, I / L- und D/ E-Selektivität dargestellt. Exemplarisch ist hier auch das Chromatogramm einer Peptidmischung mit der Ascentis Express-Säule wiedergegeben.

Wie erwartet geben die verschiedenen Säulen ein heterogenes Bild, auch die Poroshell- und RRHT1.8-Säule verhalten sich unterschiedlich.

Einfluss von Temperatur und Fluss
Für konventionelle, total poröse Silica-Partikel ist beschrieben, dass die Peptidtrennung bei höherer Temperatur besser wird. Tabelle 3 gibt die Resultate an.

Das Tailing wird mit höherer Temperatur kontinuierlich besser, die Peakfläche (gesamt) steigt geringfügig um etwa 1 % (Werte nicht im Detail angegeben).

Die Trennleistung (Peakhöhe, -kapazität) zeigt aber bei 40 °C optimale Bedingungen.

Optimale Trennleistung erfordert entsprechend der van Deemter-Gleichung eine optimale Flussgeschwindigkeit. Nach den h/u-Kurven liegt diese bei ~ 5 mm / s für sub-2 μm-Phasen und ~ 3 mm/s bei 3 μm-Partikel. Die verwendete Flussrate von 0,25 ml/min entspricht einem linearen Fluss von 2 mm/s und ist nicht optimal.

Im Hinblick auf eine Electrospray-MS-Kopplung werden aber geringe Flussraten favorisiert, da hier die Ionenausbeute gravierend zunimmt, manifestiert in der weit verbreiteten Nanobore- HPLC der Proteom-Analyse. Nach eigenen MSUntersuchungen mit den 25 Peptiden steigt die MS-Peakhöhe (basepeak-chromatogram) bei Reduktion von 0,5 auf 0,1 ml / min um den Faktor 6 (Ergebnisse nicht wiedergegeben).

Es war daher von Interesse, verschiedene Flussraten bei den Coreshell-Säulen zu testen, Tabelle 4 stellt die Ergebnisse zusammen.

Wie erwartet verbessert sich Asymmetrie und Trennleistung (Peakbreite,- kapazität) mit der Flussgeschwindigkeit, die Peakkapazität ist bei 0,1 halbiert gegenüber 0,5 ml / min. Die Peptid- Selektivitäten sind aber bei 0,25 ml / min optimal. Hier ist je nach Applikation ein Kompromiss gefragt, welcher auch durch die eingesetzte HPLCAnlage bedingt wird.

In diesem Fall wurden alle Untersuchungen mit einer Agilent 1100-HPLC durchgeführt. (Für 0,1 ml/min wurde Mischkapillare und Druckmesseinheit in den Kanal A integriert und die statische Mischkammer wesentlich verkleinert. Für Drücke über 300 bar wurde die Druckausgabe mit Hilfe eines Upgrade-Kit, Fischer Analytics, Bingen, heruntergeregelt, so dass ein Druckabfall bis 600 bar faktisch möglich wird.)

Zusammenfassung
Im Vergleich zu einer total porösen sub-2-μm- Phase ist bei isokratischen Trennungen die Trennleistung von guten Coreshell-Säulen wie erwartet geringer, bei der Gradientelution von Peptiden können aber keine Unterschiede mehr festgestellt werden. Der Einsatz von sub-2-μm -Phasen mit den bekannten technischen Schwierigkeiten ist beim Peptid-Map nicht zwingend nötig, so dass mit konventionellen HPLC-Systemen entsprechende Trennungen erreicht werden. Eine Elutionstemperatur von 40 °C ist optimal, Ameisensäure im Eluenten sollte nicht verwendet werden, da alle Phasen damit instabil sind. Im Hinblick auf eine MS-Kopplung bietet eine Flussrate von 0,1 ml / min beste Signalhöhen aber deutlich reduzierte Trennleistung. Hier wäre eine 1 mm-Säule für die Peptidtrennung ideal, die aber z. Zt. von keinem Hersteller angeboten wird.

Danksagung
Wir danken den involvierten Firmen für Ihre Unterstützung und die angeregte, teilweise lebhafte Diskussion.

Literatur
[1] Gritti F. et al.: J. Chromatography A, 1236, 28–41 (2012)
[2] Marchetti N. et al.: J. Chromatography A, 1176, 1–2, 206–216 (2007)
[3] Neue U. D.: J. Chromatogr. A, 849, 101–116 (1999)
[4] Reh E. et al.: Chromatographia, 30, 663–674 (1990)
[5] Neue U.D.: J. Chromatogr. A, 1079, 153–161 (2005)
[6] E. Reh et al.: J. Chromatogr. B, 844/2 204–212 (2006)

Anhang (beim Autor erhältlich)
- Gleichungen
- Apparative Bedingungen
- Peptidliste

Autoren
Michael Müller, Prof. Dr. Eckhard Reh,
Fachhochule Bingen

Kontakt
Dipl. Ing (FH) Michael Müller
Fachhochschule Bingen
Zentrum Proteinanalyse, Bingen,
muellermicha@fh-bingen.de

Kontaktieren

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.