Innovative Sorbentien

  • Dr. Volker Müller, Protein Purification Spezialist, Pall   Dr. Volker Müller, Protein Purification Spezialist, Pall
  • Dr. Volker Müller, Protein Purification Spezialist, Pall
  • Dr. Dirk Sievers, Marketing Manager, Pall
  • Abb. 1: Gel-in-a-Shell Design: Ein Hydrogel mit funktionellen Gruppen wird in situ innerhalb der Gigaporen eines robusten Keramikgerüstes polymerisiert. Das Ergebnis ist ein Sorbens, das für schnellen Massentransfer und effektives Bindungsverhalten steht.
  • Abb. 2: Die Untersuchung mit goldmarkiertem Albumin zeigt unter dem Elektronenmikroskop eine homogene Verteilung des Proteins auf das gesamte Hydrogel.
  • Tab. 1: Übersicht der AcroSep Ceramic HyperD F Säulen (50 μm). Die dynamischen Bindungskapazitäten wurden bei 10 % Breakthrough, 200 cm/h und 1,66 ml Bettvolumen in gepackten Säulen (5 mm ID, 100 mm Betthöhe) mit folgenden Proteinlösungen bestimmt: 5 mg/ml IgG in 50 mM Natriumacetat-Puffer, 100 mM NaCl, pH 4,7 (CM). 5 mg/ml BSA in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,6 (DEAE, Q). 5 mg/ml Lysozym in 50 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,5 (S).
  • Abb. 3: Vergleich durchschnittlicher dynamischer Bindungskapazitäten (10 % Breakthrough) für Ceramic HyperD AcroSep-Säulen und Säulen mit herkömmlichen Softgelen. Flussrate: 3,56 ml/min. Proteinkonzentration: 5 mg/ml. BSA für Q und DEAE. Lysozym für S, IgG für CM.
  • Abb. 4: Trennung von BSA und Conalbumin. Vergleich der Auflösung auf AcroSep Q Ceramic HyperD F (3 Replikate) und einem herkömmlichen Softgel bei unterschiedlichen Flussraten. Oben: Flussrate: 1 ml/min, AcroSep Ceramic HyperD F (blau, braun, pink), RS = 1,45; Softgel mit Q-Modifikation (rot), RS = 0,92. Unten: Flussrate: 4 ml/min, AcroSep Ceramic HyperD F (blau, braun, pink), RS = 1,4; Softgel mit Q-Modifikation (rot), RS = 0,54.

Klassiker im neuen Gewand – Innovative Sorbentien für die Proteinchromatographie.

Die Biotechnologie erzielte in den vergangenen Jahrenrasante Fortschritte, die die Anforderungen an die Aufreinigung und Analytik von Proteinen haben steigen lassen. Als direkte Folge ergibt sich ein erheblicher Bedarf an leistungsfähigeren Sorbentien für die Biochromatographie.

Die Umsetzung dieser Vorgaben kann einerseits über die Weiterentwicklung etablierter Trenntechniken erfolgen, darunter die Ionenaustauschchromatographie (IEX) oder die Affinitätschromatographie (AC).

Andererseits besteht die Möglichkeit der Entwicklung modifizierter Sorbentien, die neuartige Wechselwirkungsmechanismen zwischen Protein und Sorbens nutzen. Der vorliegende Artikel befasst sich schwerpunktmäßig mit der ersten Option, wirft aber auch einen Blick auf die zweite Variante.

Einer der Nachteile gängiger IEX-Sorbentien ist die Komprimierbarkeit des Softgels. Die Suche nach einem robusteren und stabileren Partikel, gepaart mit hoher Kapazität und der Trennleistung konventioneller IEX-Softgele, führte zur Entwicklung des patentierten Gel-in-a-Shell Konzepts.

 


Gel-in-a-Shell Design

Das Konzept steht für schnellen Massentransfer und effektives Bindungsverhalten.

Das Prinzip basiert auf einem Hydrogel hoher Kapazität, das in situ innerhalb der Gigaporen (> 0,2 μm) eines robusten keramischen Gerüstes polymerisiert wird, welches mit Drücken bis 200 bar kompatibel ist (Abb. 1).

Dieses Hydrogel trägt die für die chromatographische Trennung relevanten funktionellen Gruppen. Die offenporige Struktur der Keramikpartikel ermöglicht eine ausgezeichnete Mobilität der Proteine innerhalb des Hydrogels, sodass die Prozesse der Adsorption und Elution sehr schnell und gleichmäßig ablaufen.

Untersuchungen mit goldmarkiertem Albumin zeigen unter dem Elektronenmikroskop eine homogene Verteilung des Proteins über das gesamte Hydrogel (Abb. 2).

Das Design erlaubt hohe dynamische Bindungskapazitäten bei gleichzeitig hohen Flussraten. Damit sind schnellere Aufreinigungen gewährleistet, die insbesondere dann von Bedeutung sind, wenn die aufzuarbeitenden Proteine sehr empfindlich sind.

Die Proteine können sehr effizient und schnell an die in hoher Dichte (150-400 μeq/ml) vorliegenden funktionellen Gruppen des Hydrogels binden.

Das Gel-in-a-Shell Design ermöglicht auf diese Weise ein erheblich schnelleres Arbeiten als konventionelle Softgele.

Die Faktoren Auflösung, Geschwindigkeit und Kapazität werden in idealer Weise verbunden.

Das Design umgeht die seitens klassischer IEX-Softgele bekannte Problematik des Aufquellens und der Komprimierbarkeit. Auch Änderungen der Leitfähigkeit oder des pH-Werts der mobilen Phase bereiten diesbezüglich keine Schwierigkeiten.

Die Sorbentien stehen darüber hinaus für ein reproduzierbares Packverhalten. Sie repräsentieren ein wichtiges Werkzeug zur Steigerung der Produktivität in der Ionenaustauschchromatographie.

 


IEX-Sorbentien für die Ionenaustauschchromatographie

Die Ceramic HyperD Sorbentien (50 μm) für die Ionenaustauschchromatographie, deren Struktur auf dem Gel-in-a-Shell Design basiert, zeichnen sich durch hervorragende Flussleistungen aus.

Die Sorbentien bieten hohe dynamische Bindungskapazitäten, die auch bei hohen linearen Geschwindigkeiten in der Säule erhalten bleiben. Sie werden als starke und schwache Anionenaustauscher und Kationenaustauscher angeboten.

Somit sind es vier IEXSorbentien, die die Vorteile des Gel-in-a-Shell Konzepts nutzen:

die starken und schwachen Anionenaustauscher Q und DEAE und die starken und schwachen Kationenaustauscher S und CM. Sie eignen sich beispielsweise zur Auftrennung monoklonaler und polyklonaler Antikörper, rekombinanter Proteine, Plasmide, Proteine oder Vakzine.

Die verfügbaren Ceramic HyperD Sorbentien ermöglichen ein effizientes Sorbentienscreening zur schnellen Bestimmung der für eine spezifische Proteinauftrennung optimalen IEX-Phase.

Darüber hinaus eignen sie sich hervorragend für Optimierungsprozesse unter Verwendung geringster Volumina, beispielsweise zu Beginn einer Aufskalierungsstudie.

Q und S Ceramic HyperD Sorbentien sind zudem als 20 μm Partikel verfügbar, die eine verbesserte Auflösung für anspruchsvollste Trennprobleme bieten. Alle Sorbentien sind sowohl für den Labor- als auch den Pilotund Prozessmaßstab verfügbar.

 


Säulen mit IEX-Sorbentien

Alle aufgeführten Sorbentien (50 μm) stehen als vorgepackte AcroSep-Säulen (1 ml) zur einfachen und schnellen Proteinauftrennung zur Verfügung. Die Säulen verfügen über Luer-Lock-Anschlüsse (Inlet und Outlet), sodass sie mit gängigen Biochromatographiesystemen, peristaltischen Pumpen oder Einwegspritzen vollständig kompatibel sind.

Die Polypropylen-Säulen ermöglichen Hochgeschwindigkeitstrennungen mit hohen Flussraten (bis 4 ml/min) ohne signifikante Einbußen hinsichtlich Auflösung und Kapazität.

Auf diese Weise lässt sich der Probendurchsatz erheblich steigern, sodass im gleichen Zeitfenster mehr Proben als zuvor aufgearbeitet werden können. Die hohe Trennleistung ermöglicht die Auftrennung auch strukturell ähnlicher Proteine. AcroSep-Säulen sind mit Drücken bis 3 bar kompatibel. Der empfohlene Flussbereich liegt bei 1 - 4 ml/min.

Tabelle 1 fasst typische dynamische Bindungskapazitäten der vorgestellten Säulen zusammen. Die durchschnittlichen dynamischen Bindungskapazitäten liegen im Falle der mit Ceramic HyperD Sorbentien gepackten AcroSep- Säulen gerade bei hohen Flussraten erwartungsgemäß deutlich über denen herkömmlicher Softgele in vergleichbarer Säulenhardware (Abb. 3).

Ein Vergleich der Auflösung auf AcroSep Q Ceramic HyperD F Säulen und einem konventionellen Softgel bei unterschiedlichen Flussraten zeigt im Falle der AcroSep-Säulen sehr gute und reproduzierbare Ergebnisse sowohl bei geringerer Flussrate (1 ml/min) als auch bei höherer Flussrate (4 ml/min).

Anders als bei herkömmlichen Softgelen wird eine Abnahme der Auflösung bzw. Trennleistung nicht beobachtet (Abb. 4).

 


Aufarbeitung von Antikörpern

Ein weiteres Material, das auf Basis des Gel-in-a-Shell Konzepts hergestellt wird, ist das Protein A Ceramic HyperD Sorbens.

Die Protein A Chemie ist infolge ihrer hohen Selektivität sehr gebräuchlich zur Aufreinigung monoklonaler Antikörper, die derzeit etwa 35 % aller sich in klinischen Studien befindlichen Proteine repräsentieren.

Neben den hohen Kosten dieser Sorbentien muss allerdings die Einstellung stark saurer Elutionsbedingungen (pH < 3) in Kauf genommen werden, die einen negativen Einfluss auf die Integrität und damit die Ausbeute der Zielproteine haben.

Neue Ansätze auf Basis modifizierter chromatographischer Mechanismen versuchen diese Nachteile zu umgehen. Als Alternative zur Protein A Affinitätschromatographie bietet sich MEP HyperCel an, das sich insbesondere in Kombination mit der Ionenaustauschchromatographie zur Protein A freien Aufreinigung verschiedenster Spezies und Subklassen monoklonaler Antikörper eignet.

Die Bindungskapazitäten entsprechen in etwa denen gängiger Protein A Sorbentien. Das Sorbens ist zudem gegenüber harschen Regenerationsbedingungen (1 N NaOH) resistent, woraus unmittelbar eine höhere Lebensdauer folgt.

 


Mixed-Mode Chromatographie

Die HyperCel Familie repräsentiert eine neue Kategorie leistungsstarker Sorbentien für die Proteinchromatographie. Sie umfasst aktuell drei Modifikationen: MEP HyperCel, HEA HyperCel und PPA HyperCel.

Alle diese Sorbentien agieren im Sinne eines Mixed-Mode Mechanismus, der primär auf hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Probe und Sorbens unter neutralen („physiologischen") Bedingungen (PBS, pH 7,4) basiert.

Sie bieten somit zusätzliche Selektivitäten für die Biochromatographie therapeutischer Proteine. MEP HyperCel ist unter Beladungsbedingungen nicht geladen, während die Proteine (partiell) positiv geladen vorliegen. Die Elution erfolgt nach moderater pHSenkung durch elektrostatische Abstoßung positiver Ladungen.

Diese pH-Senkung induziert eine positive Ladung der Liganden und verstärkt zudem die positive Proteinladung.

1) HEA HyperCel und PPA HyperCel sind dagegen bereits unter Beladungsbedingungen (partiell) positiv geladen, sodass die pHSenkung eine Verstärkung sowohl der Sorbens- als auch der Proteinladung bewirkt.

Als Folge ergibt sich die angesprochene elektrostatische Abstoßung. Sobald diese die hydrophoben Wechselwirkungen in ihrer Stärke übertrifft, löst sich die Probe von der Säule. In der Regel reichen pH-Werte zwischen pH 4,5 und pH 4,0 aus. Diese vergleichsweise milden Bedingungen fördern den Erhalt der biologischen Integrität der Zielproteine.

 


Zusammenfassung

Innovative Sorbentien für die moderne Proteinchromatographie im Labor-, Pilot- und Prozessmaßstab bieten dem Anwender wesentliche Leistungsvorteile. Sie lassen sich sowohl zur routinemäßigen und schnellen Aufreinigung und Analyse von Proteinen einsetzen als auch für ein effizientes Sorbentienscreening auf der Suche nach der optimalen Phasenchemie.

Die hohe Kapazität, Robustheit und Trennleistung unterstützt den Anwender im Streben nach hoher Effizienz und Wirtschaftlichkeit.

1) Dieser Sonderfall wird auch als Hydrophobic Charge Induction Chromatography (HCIC) bezeichnet.

 


Literatur

[1] Guerrier L. et al.: Bioseparation, Vol. 9, No. 4, 211-221
[2] Staby A. et al.: J Chromatography A, Vol. 1164, Issues 1-2, 82-94 (2007)

 


Kontakt

Dr. Volker Müller
Life Sciences, BioSciences
Tel.: 06103/307-0
Fax: 06103/307-295
volker.mueller@europe.pall.com

Dr. Dirk Sievers
Life Sciences, BioPharmaceuticals
Tel.: 06103/307-582
Fax: 06103/307-295
dirk.sievers@europe.pall.com

Pall GmbH
Dreieich, Germany

 

 

 

 

 

 

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