Intrazelluläres Lineal

EPR-basierte Strukturaufklärung von Biomolekülen

  • Abb. 2: Die Proteinmutante CYP101 C58 wird mit einem Tritylradikal gelabelt, in lebende Froschoozyten injiziert und die Abstandsverteilung zwischen dem Trityl und dem nativem Eisen(III) mittels RIDME gemessen (grün: in-cell, blau: in vitro).Abb. 2: Die Proteinmutante CYP101 C58 wird mit einem Tritylradikal gelabelt, in lebende Froschoozyten injiziert und die Abstandsverteilung zwischen dem Trityl und dem nativem Eisen(III) mittels RIDME gemessen (grün: in-cell, blau: in vitro).
  • Abb. 2: Die Proteinmutante CYP101 C58 wird mit einem Tritylradikal gelabelt, in lebende Froschoozyten injiziert und die Abstandsverteilung zwischen dem Trityl und dem nativem Eisen(III) mittels RIDME gemessen (grün: in-cell, blau: in vitro).
  • Abb. 1: Ausgewählte Spinlabeltypen, die in der EPR-Spektroskopie zum Einsatz kommen: a) etablierte Nitroxidradikale, b) neuartige Nitroxidradikale c) Gadolinium(III)komplexe und d) Tritylradikale.
  • © Olav Schiemann
  • Dipl. Chem. Jean Jacques Jassoy
  • Prof. Dr. Olav Schiemann,
Die Kombination aus Elektronen Paramagnetischer Resonanz- (EPR) Spektroskopie und ortsspezifischer paramagnetischer Markierung (site-directed spin labeling, SDSL) wird seit 25 Jahren zur Struktur- und Dynamikaufklärung von Biomolekülen verwendet. Die Anwendungsgrenzen der bisher etablierten organischen Nitroxidradikalmarker können durch neue Spinlabel überwunden werden, um das Potential der Methode in erheblichem Ausmaß zu steigern.
 
Die Strukturaufklärung von Proteinen, DNA- und RNA-Oligomeren ist eine wichtige Voraussetzung für das tiefere Verständnis von Stoffwechselvorgängen in lebenden Organismen. Auf diesem Verständnis baut wiederum die Entwicklung neuer Medikamente sowie die Etablierung neuer biotechnologischer Methoden für industrielle Produktionsverfahren auf. Gemessen an diesem großen Anwendungspotential geht die Identifizierung biomakromolekularer Strukturen schleppend voran. Moderne Modellierungsprogramme (z. B. Rosetta) liefern auf Grundlage von Sequenzinformationen immer bessere Vorhersagen, benötigen aber eine im Vergleich zu heute deutlich erweiterte experimentelle Datenbasis für die Erschließung zuverlässiger Faltungsregeln [1]. Allein von den etwa 500.000 Proteinvarianten des menschlichen Proteoms sind bisher erst etwa 8.000 Strukturen gelöst worden (>60 % Peptidkettenabdeckung), viele davon nur fragmentarisch [2,3]. Für manche Proteine müssen erst noch die passenden Expressionsbedingungen gefunden werden, in anderen Fällen stoßen die etablierten Strukturanalyseverfahren an ihre Grenzen. 
 
Etablierte Strukturanalyseverfahren
 
Kristallografische Analyseansätze scheitern oftmals an der Züchtung geeigneter Kristalle, die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) verliert mit steigender Proteingröße (>100 kDa) zunehmend an Auflösung [4]. Die Struktur und Dynamik von Proteinen wurde mittels NMR auch in Zellen untersucht, allerdings erfordert dies auf Grund der intensiven Hintergrundsignale gezielte Isotopenmarkierung und relative große Probenmengen in der Zelle (4 nmol/Zelle) [5].
 
Gepulste EPR-Experimente
 
Komplementär zu Kristallografie und NMR stellt die Kombination von SDSL und EPR-basierten Abstandsmessungen eine wichtige Ergänzung im Bereich der biomakromolekularen Strukturanalyse dar [6,7].

Sie ermöglicht beispielsweise die Bestimmung der Topologie in großen Protein-Protein- [8], Protein-RNA- [9] und Protein-Substrat-Komplexen [10], sowie die Untersuchung von Oligonukleotiddynamiken [11], das Zählen von Monomeren in biomolekularen Komplexen [12,13], die Gewinnung von Winkelinformationen [14], oder die Triangulation von paramagnetischen Metallzentren in Proteinen [15]. Die Abstände werden aus der Dipol-Dipolwechselwirkung zwischen paramagnetischen Zentren berechnet und es können im Vergleich zur NMR längere Abstände von bis zu 15 nm gemessen werden [16], weil das magnetische Moment ungepaarter Elektronen um etwa drei Größenordnungen größer als das von Atomkernen ist. Gleichzeitig ermöglicht die Empfindlichkeit der EPR-Spektroskopie die Bestimmung zuverlässiger intrazellulärer Strukturdaten schon aus Probenmengen nahe den physiologischen Konzentrationen (100 pmol / Zelle) [17]. Weiterhin ist der überwiegend diamagnetische Zellhintergrund für EPR-Messungen unsichtbar, die Interferenz geringer Mengen paramagnetischer Ionen und kurzlebiger organischer Radikale kann meistens anhand ihrer spektroskopischen Signatur identifiziert und vom gewünschten Signal separiert werden.

 
Spinlabel
 
Die zur EPR-Abstandsbestimmung benötigten paramagnetischen Zentren (Spinlabel, Abb. 1) können entweder intrinsisch im Biomolekül vorhanden sein, z. B. paramagnetische Metallionen, oder via SDSL in die Biomolekülstrukturen eingebracht werden. Die Biokonjugation erfolgt entweder während der Biomolekülsynthese [18] oder postsynthetisch durch z. B. „Click“-Reaktionen der Spinlabel an chemoselektiven Positionen im entsprechend präparierten Biomolekül [6,17,19]. Hierbei gibt es im Prinzip sowohl für Proteine als auch Oligonukleotide Methoden um die Label an nahezu jeder gewünschten und zugänglichen Stelle im Biomolekül anzubringen [20]. Zu beachten ist dabei, dass die eingeführten Label nicht zu einer Struktur- bzw. Funktionsänderung führen. Dies kann z. B. durch Funktionsassays geprüft werden. Die bisher für gepulste EPR-Messungen etablierten Nitroxidradikallabel erfordern tiefe Temperaturen zur Verlangsamung der Elektronenspinrelaxation und werden im Zellmedium leicht zu EPR-inaktiven Aminen reduziert. Dementsprechend ist die Suche nach Alternativen in vollem Gange und umfasst die Erprobung modifizierter Nitroxidlabel [21], paramagnetischer Gadoliniumkomplexe [17] und stabiler Tritylradikale. Tritylspinlabel vereinen eine dem Zellinneren genügende Redoxstabilität mit einer auch bei Raumtemperatur ausreichend langen Relaxationszeit für gepulste EPR-Messungen [22]. Außerdem zeichnen sie sich durch eine schmale Linienbreite des EPR-Signals aus, was einem verbesserten Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) sowie der Anwendung zeitsparenderer Pulstechniken zugute kommen kann.
 
Intrazelluläre Abstandsbestimmung
 
Kürzlich gelang die organische Synthese neuer Tritylspinlabel mit vielfältigen Biokonjugationsmöglichkeiten (Disulfidbrücken, Thioetherbrücken, kupfer(I)katalysierte Alkin-Azid Cycloaddition, Sonogashira Kupplung) und darauffolgend die erste intrazelluläre EPR-Abstandsmessung zwischen einem Spinlabel und einem paramagnetischen, nativen Metallzentrum in einem Protein (Abb. 2) [23]. Dabei wurde zunächst eine Mutante des Proteins Cytochrom P450 CYP101 (pseudomonas putida) exprimiert, die nur ein markierbares Cystein an Position C58 enthielt. Eine Pufferlösung dieses Proteins wurde mit einem der neuen Trityllabel versetzt und vier Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Biokonjugation mittels einer Michael-Addition-ähnlichen Thiol-En-Reaktion zu erreichen. Nach einem Aufreinigungsschritt wurden jeweils 253 pmol des Proteins mit einem Mikroinjektor in lebende Froscheizellen (xenopus laevis) injiziert und 20 dieser stecknadelkopfgroßen Zellen in ein EPR-Probenröhrchen gegeben. Der Abstand zwischen dem Spinlabel und dem nativen Eisen(III)-Kofaktor des Proteins wurde mittels eines gepulsten EPR-Experiments, der Relaxation Induced Dipolar Modulation Enhancement (RIDME) Pulssequenz, bei 25 K im Q-Band gemessen. Die niedrige Temperatur trägt dabei dem Relaxationsverhalten des low-spin Eisen(III)-Zentrums Rechnung.
 
Die Auswertung der Messung ergibt einen Trityl-Eisen Abstand von 3.60 nm und ist sowohl mit den in vitro-Vergleichsmessungen am isolierten Protein als auch mit der zugehörigen in silico-Prognose konsistent. Die gleichzeitig zu einem geringen Anteil auftretenden kürzeren Abstände sind vermutlich auf Kontaktwechselwirkungen zwischen Label und Protein zurückzuführen, die Labelkonformere mit kürzeren Trityl/Eisen-Abständen induzieren. Solche Wechselwirkungen sind auch für Nitroxide oder andere Label typisch [24].
 
Zusammenfassung und Ausblick
 
Die Kombination aus SDSL und EPR-Spektroskopie ermöglicht Abstandsbestimmungen im Nanometerbereich bei nahezu beliebiger Größe der untersuchten Biomakromoleküle und stellt somit eine wichtige Ergänzung zu anderen Strukturanalyseverfahren dar. Im Vergleich zu Kristallographie und NMR sind Strukturdaten schwer kristallisierbarer und großer biomolekularer Komplexe schon bei geringen Probenmengen in vitro zugänglich. Die hier beschriebene Studie stellt einen wichtigen Schritt zur Erforschung solcher Komplexe in ihrer natürlichen Umgebung dar und zeigt erstmals die intrazelluläre Anwendung von Tritylspinlabeln. Dieser Labeltyp begründet kraft seiner spektroskopischen Eigenschaften die Hoffnung auf zukünftige EPR-Abstandsbestimmungen an Biomakromolekülen bei Raumtemperatur in lebenden Zellen. Zukünftige Arbeiten könnten wertvolle Beiträge zur Aufklärung des intrazellulären Interaktoms leisten oder auch den Einfluss der speziellen molekularen Umgebung auf Biomoleküle in Zellkompartimenten zu erforschen helfen.
 
Danksagung
 
Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Finanzierung im Rahmen des Schwerpunktprogramms SPP1601 und des Sonderforschungsbereichs SFB813.
 
Autoren
J. Jacques Jassoy1, Olav Schiemann1
 
Zugehörigkeit
1Universität Bonn, Institut für Physikalische und Theoretische Chemie, AG EPR-Spektroskopie, Bonn
 
Lebenslauf
Dipl. Chem. Jean Jacques Jassoy
Der Diplomchemiker promoviert seit 2014 in der Arbeitsgruppe von Prof. Schiemann an der Universität Bonn. Der Schwerpunkt seiner Arbeit liegt auf der Synthese von Tritylspinlabeln für EPR-basierte Abstandsmessungen. Er studierte an der Universität Bonn Chemie und fertigte seine Diplomarbeit auf dem Gebiet redoxaktiver Polymere zur Stromspeicherung bei Prof. Esser an der Universität Bonn an.
 
Lebenslauf
Prof. Dr. Olav Schiemann,
ist seit 2011 Professor für Physikalische Chemie an der Universität Bonn. Sein Hauptarbeitsgebiet ist die EPR-Spektroskopie mit Anwendungen in der Strukturbiologie. Er studierte Chemie an der Universität Marburg und promovierte dort in der Gruppe von C. Elschenbroich mit einer Arbeit zur Organometallchemie. Nach einem Postdoktorat bei J. K. Barton (Caltech) mit Arbeiten zum Elektronen Transfer in DNA habilitierte er sich an der Universität Frankfurt in der Arbeitsgruppe von T. F. Prisner mit einem Thema zur EPR Spektroskopie. Von 2007 bis 2014 war er erst Lecturer, dann Reader und schließlich Professor am Biomedical Sciences Research Center der Universität St. Andrews in Schottland.
 
Kontakt 
Prof. Dr. Olav Schiemann
Institut für Physikalische und Theoretische Chemie
Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
Bonn
 
 

Literatur:

[1] P.-S. Huang, S. E. Boyken, D. Baker, Nature 2016, 537, 320. DOI: 10.1038/nature19946

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[3] www.rcsb.org, H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T. N. Bhat, H. Weissig, I. N. Shindyalov, P. E. Bourne, Nucleic Acids Res. 2000, 28, 235. PMCID: PMC102472

[4] A. Viegas, T. Viennet, M. Etzkorn, Biol. Chem. 2016, 397, 1335. DOI: 10.1515/hsz-2016-0224

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[14] V. P. Denysenkov, T. F. Prisner, J. Stubbe, M. Bennati, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 13386. DOI: 10.1073/pnas.0605851103

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[23] J. J. Jassoy, A. Berndhäuser, F. Duthie, S. P. Kühn, G. Hagelueken, O. Schiemann, Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 177. DOI: 10.1002/anie.201609085

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