IRRA-Spektroskopie an Lipid-/Proteinmonoschichten

IR-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie zum Studium der Lipid/Protein-Wechselwirkung

  • Abb. 1a: Schema des IRRAS-Aufbaus, Filmwaage mit beweglichen Barrieren und Wilhelmy-Oberflächendruck-Mess-System.Abb. 1a: Schema des IRRAS-Aufbaus, Filmwaage mit beweglichen Barrieren und Wilhelmy-Oberflächendruck-Mess-System.
  • Abb. 1a: Schema des IRRAS-Aufbaus, Filmwaage mit beweglichen Barrieren und Wilhelmy-Oberflächendruck-Mess-System.
  • Abb. 1b: Abbildung des IRRAS-Aufbaus, Filmwaage mit beweglichen Barrieren und Wilhelmy-Oberflächendruck-Mess-System.
  • Abb. 2: IRRA-Spektren zur Wechselwirkung eines Proteins mit einem Lipidfilm.
  • Abb. 3: IRRA-Spektren von EGFP sowie i16/EGFP (siehe Text) sowie eine schematische Darstellung des Adsorptionsverhaltens der Proteine an eine Monoschicht aus Lipiden der Thylakoidmembran (siehe [6]).
  • Abb. 3: IRRA-Spektren von EGFP sowie i16/EGFP (siehe Text) sowie eine schematische Darstellung des Adsorptionsverhaltens der Proteine an eine Monoschicht aus Lipiden der Thylakoidmembran (siehe [6]).
  • Prof. Dr. Alfred Blume, Arbeitsgruppenleiter, Biophysikalische Chemie, MLU
  • Dr. Andreas Kerth, Wissenschaftlicher, Mitarbeiter am Lehrstuhl Biophysikalische Chemie, MLU

Lipidmonoschichten an der Luft / Wasser-Grenzfläche stellen quasi die Hälfte einer biologischen Lipiddoppelschicht dar. Die Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie (IRRAS) ist eine exzellente Methode, um die Wechselwirkung von Peptiden und Proteinen mit Lipidmonoschichten und die dabei auftretenden Sekundärstrukturänderungen der Proteine zu untersuchen.

Das „Flüssig-Mosaik-Modell" nach Singer und Nicholsen in seiner modifizierten Form mit einer inhomogenen Verteilung von Lipiden und Proteinen in der Membranebene wird auch heute noch zur Beschreibung des Aufbaus der biologischen Zellmembran verwendet [1]. Lipidmonoschichten an der Wasser-Luft-Grenzfläche stellen ein geeignetes Modell dieser biologischen Lipiddoppelschicht dar, da sie als ein System von zwei schwach gekoppelten Monoschichten betrachtet werden kann. Die Wechselwirkung von wasserlöslichen Proteinen oder Peptiden (jedoch nicht Membranproteine) mit Lipidmonoschichten können mit diesem Modellsystem sehr gut untersucht werden [2]. Die Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie (IRRAS) ermöglicht dabei die Untersuchung der An- bzw. Einlagerung von Proteinen und deren mögliche Sekundärstrukturänderungen [3].

IRRAS-Grundlagen
Die IRRA-Spektroskopie wurde unter anderem zur Untersuchung von Monoschichten von amphiphilen Molekülen an der Wasseroberfläche etabliert. Zuerst wurden reine Lipidfilme an der Wasser-Luft-Grenzfläche untersucht, ehe die Wechselwirkung von Peptiden und Proteinen mit Lipidmonoschichten IRRA-spektroskopisch verfolgt wurde. Die IRRA-Spektroskopie ermöglicht nun die Bestimmung der Konformation und der Orientierung von Lipidketten. Des Weiteren können Informationen über die Lipidkopfgruppen, z. B. deren Hydratisierung, sowie die Kopfgruppen-Wechselwirkungen mit Stoffen der wässrigen Subphase erhalten werden. Außerdem können neben Lipidfilmen auch Protein- oder Peptidfilme untersucht werden, wobei deren unterschiedliche Anteile von Sekundärstrukturelementen sowie deren Orientierung bestimmt werden kann. Bei Studien der Wechselwirkung von Proteinen oder Peptiden mit Lipidmonoschichten können ebenfalls Aussagen über Änderungen der Lipidordnung, der Proteinstruktur und -orientierung aus den IRRA-Spektren ermittelt werden.

Die Methode hat unter anderem deswegen Vorteile, weil der einfallende IR-Strahl nur eine sehr geringe Eindringtiefe in die Wasserphase hat, so dass bei sehr geringen Proteinkonzentrationen (ca. 100 nM oder weniger) nur direkt an der Oberfläche lokalisierte Moleküle durch den IR-Strahl „gesehen" werden. Mittels eines Trog-„Shuttles" wird zwischen Referenz- und Probentrog gewechselt, so dass innerhalb kürzester Zeit Referenz- und Probenreflektivitäts-Spektrum (R0 bzw. R) gemessen werden können (Abb. 1).

Die resultierenden Spektren (-log R/R0) sind nun analog IR-Transmissions-Messungen analysierbar (Abb. 2). Die Form und Lage der Schwingungsbanden ermöglicht direkte Rückschlüsse auf die molekularen Strukturen bzw. die Konformationen der Moleküle. Die relevanten Schwingungsbanden sind bei Lipiden z. B. die CH2-Streckschwingungsbanden der Acylketten oder die Carbonyl- bzw. Phosphatschwingungsbanden der Phospholipidkopfgruppen. Bei Peptiden und Proteinen werden hauptsächlich die Amid I- und Amid II-Banden analysiert. Während der Kompression eines Oberflächenfilms werden Oberflächendruck-Flächen-(π/A)-Isothermen und IRRA-Spektren komplementär aufgenommen. Adsorptionsexperimente von Peptiden oder Proteinen, bei denen diese in die Subphase unter die Lipidmonoschicht injiziert und dann zeitabhängig die Spektren gemessen werden, können entweder bei einem konstanten Oberflächendruck oder bei einer konstant gehaltenen Fläche durchgeführt werden. Die Analyse der OH-Streckschwingungsbande bei hohen Wellenzahlen bietet die Möglichkeit Aussagen über die Filmdicke zu treffen [4]. Damit kann z. B. entschieden werden, ob sich Peptide in den Film einlagern oder ob sie nur peripher gebunden werden, da Letzteres mit einer Zunahme der Filmdicke verbunden ist.

Die Orientierung der Moleküle wird durch die Messung von IRRA-Spektren bei unterschiedlichen Einfallswinkeln und mit zwei verschiedenen Polarisationsrichtungen des IR-Strahls bestimmt (s- bzw. p-Polarisation). Bei Lipiden ist die Ausrichtung von geordneten Acylketten durch die Messung der Intensität der CH2-Streckschwingungsbanden als Funktion des Einfallswinkels ermittelbar. Bei Peptiden, die nur eine bestimmte Sekundärstruktur ausbilden, wie z. B. eine α-Helix oder ein β-Faltblatt ist dies aus der Analyse der Intensität der Amid I-Bande möglich. Im letzteren Fall ergibt sich der Winkel der Orientierung der Längsachse der Helix oder der Vorzugsachse des Faltblatts relativ zur Lipid-Wasser-Grenzfläche. Bei Proteinen, bei denen alle enthaltenen Sekundärstrukturelemente aus Röntgendaten bekannt sind, ist dies im Prinzip auch möglich, nur müssen hier die Richtungen aller Sekundärstrukturelemente und ihre jeweiligen Anteile aufsummiert werden [5].

Wechselwirkungen von Tat-Substraten mit Lipidmonoschichten
Als Beispiel für die Möglichkeiten der IRRA-Spektroskopie soll hier die Wechselwirkung von Tat-Substraten an Lipidmonoschichten erläutert werden. Das sogenannte Tat-Transportsystem („twin arginine translocation" pathway) ermöglicht den Transport von gefalteten Proteinen über biologische Membranen. Das zu transportierende Protein besteht dabei aus einem „precursor"-Protein, das ein Signalpeptid mit einem charakteristischen Zwillings-Argininpaar besitzt. Mittels IRRAS ließ sich nun klären, dass sich diese Substrate sehr effektiv an die jeweilige Membran anlagern (Thylakoid- bzw. Bakterienmembran) [6]. Diese Adsorption erlaubt über einen zweidimensionalen Diffusionsmechanismus eine effiziente Weiterleitung der Substrate an das eigentliche membrangestützte Tat-Translokations-System, wobei dieser weitere Transport natürlich nicht mit der monoschichtbasierten IRRAS-Technik verfolgbar ist. Die IRRA-Spektren zeigen, dass das Signalpeptid essentiell zur Adsorption an die Lipidschicht ist und dabei eine α-helikale Sekundärstruktur annimmt. Abb. 3 zeigt die Wechselwirkung eines Modelsubstrates („enhanced green fluorescent protein": EGFP; „precursor"-Protein: i16/EGFP) an der Wasser-Luft- sowie Wasser-Lipid-Grenzfläche. Zu sehen ist die überwiegende β-Faltblattstruktur des EGFP, sowie der zusätzliche α-helikale Anteil des Signalpeptids im i16/EGFP. Die Adsorption an eine Thylakoidmonoschicht erhöht diesen α-helikalen Anteil noch weiter.

Weitere Einsatzmöglichkeiten der Technik
Die Wechselwirkung von kationischen, amphipathischen KLAL-Modellpeptiden mit anionischen POPG-Lipidmonoschichten wurde ebenfalls studiert. Die Lage der Amid-I-Bande zeigt eine α-helikale Sekundärstruktur der Peptide an. Im Gegensatz dazu aggregiert das Modellpeptid an der reinen Wasser-Luft-Grenzfläche zu vorwiegend antiparallelen β-Faltblattstrukturen [7].

Das Lipid A stellt das „endotoxische Prinzip" der Lipopolysaccharide der äußeren Membran gram-negativer Bakterien dar. Die Interaktion von humanem Lactoferrin (hLf) mit einer Lipid A-Monoschicht zeigt, dass das hLf an diese Lipidmonoschicht adsorbiert ohne dabei aber in die Lipidschicht zu insertieren. Des Weiteren veränderte sich die hauptsächlich α-helikale Sekundärstruktur des Proteins nicht [8].
Eine Fragestellung, die sich mit Hilfe von IRRAS an Monoschichten ideal klären lässt, ist die Bindung von Proteinen an Membranen, die sogenannte Lipidanker tragen. Als Beispiel hierfür sei das Protein NRAS genannt, das mit Hilfe von zwei langkettigen Alkylresten in die Membran eingelagert wird [4].

Des Weiteren wurden auch die Wechselwirkung von Lipidmonoschichten mit Amyloid β-Peptid [9] bzw. Hsp12 [10] untersucht.

Literatur
[1] Bagatolli L. A. et al.: Progress in Lipid Research 49, 378-389 (2010)
[2] Maget-Dana R.: Biochim. Biophys. Acta 1462, 109-140 (1999)
[3] Mendelsohn R. et al.: Biochim. Biophys. Acta 1798, 788-800 (2010)
[4] Hussain H. et al.: J. Phys. Chem. B 108, 9962-9969 (2004)
[5] Meister A. et al.:: Biophys. J. 91, 1388-1401 (2006)
[6] Kerth A. et al.: ChemBioChem 13, 231-239 (2012)
[7] Erbe A. et al.: ChemBioChem 10, 2884-2892 (2009)
[8] Kerth A. et al.: Med. Chem. 5, 535-542 (2009)
[9] Maltseva E. et al.: ChemBioChem 6, 1817-1824 (2005)
[10]  Welker S. et al.: Molecular Cell 39, 507-520 (2010)

Autor(en)

Kontaktieren

MLU Universität Halle-Wittenberg - Biophysikalische Chemie

06099 Halle

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.