Kopplungsmethoden in der Massenspektrometrie

  • Abb. 1: Schematische Darstellung der Ionisierungstechniken A) Elektronenstoßionisation (EI), B) Felddesorption (FD/FI/LIFDI), C) Elektrosprayionisation (ESI) und D) Matrix-Assisted-Laser-Desorption Ionization (MALDI). Eine Beschreibung der ablaufenden Prozesse findet sich im Text.
  • Abb. 2: Darstellung der Einsatzbereiche der gebräuchlichsten Ionisierungstechniken hinsichtlich Polaritäten und Molekulargewichte der Analyten.

 

Bis in die 1990er Jahre war die Kopplung von „massenselektiven Detektoren“ mit Trenntechniken beschränkt auf Gaschromatographen. Die Entwicklung neuer Ionisationstechniken hat die Kopplungsmöglichkeiten seitdem stark erweitert auf alle anderen gängigen Trenntechniken. Kopplungsmethoden in der Massenspektrometrie sind heute nicht mehr wegzudenken aus der chemischen, der Umwelt-, der Lebensmittel- der Pharma- und der Bioanalytik.
 
 
Warum Kopplung von Trenntechniken und Massenspektrometrie?
Chromatographie und Elektrophorese eignen sich hervorragend zur Trennung komplexer Probengemische. Gerade bei sehr komplexen Proben oder gar unbekannten Verbindungen reicht der Informationsgehalt von z. B. UV‑Vis in der Flüssigkeits- oder Flammenionisationsdetektoren in der Gaschromatographie aber oft nicht aus, um Verbindungen sicher identifizieren zu können.
Massenspektrometer auf der anderen Seite liefern Informationen zur molekularen Zusammensetzung und im Idealfall auch zur Struktur chemischer Verbindungen. Leistungsfähige Geräte können Massen dabei sehr genau und mit hoher Auflösung bestimmen, so dass zumindest für kleine Moleküle direkt Summenformeln erhalten werden können. Über Fragmentionenspektren lassen sich zudem strukturelle Informationen gewinnen. Bei komplexen Mischungen kann es allerdings zu Ionensuppressionseffekten und ggf. auch zu störenden Signalüberlagerungen kommen. Speziell bei Elektronenstoßionisation (EI) ist eine sichere Zuordnung der durch die Ionisierungstechnik bedingten Fragmentionensignale bei Stoffgemischen in der Regel nicht möglich. Zudem reicht bei limitierter Probenmenge und gezielter Fragmentierung einzelner Komponenten die verfügbare Messzeit in der Regel nicht aus, um alle Komponenten zu fragmentieren. Bei isobaren Verbindungen kann auch die Isolationsbreite limitierend sein.
Es ist also nur logisch und konsequent, beide Methoden zu kombinieren und so die jeweiligen Limitationen der einzelnen Methoden zu eliminieren.
 
Kopplung von Gaschromatographie mit Massenspektrometrie (GC-MS)
Die Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Kopplung (GC-MS) ist die historisch gesehen älteste der hier vorgestellten Kopplungstechniken, da die für die GC-MS-Kopplung geeigneten Ionisierungstechniken Elektronenstoßionisation (EI), Chemische Ionisation (CI) sowie Feldionisation (FI) bereits viele Jahrzehnte kommerziell verfügbar sind [1].

Alle drei genannten Techniken ionisieren die Analytmoleküle im Geräte-Inneren, also im Hochvakuum des Massenspektrometers und setzen – wie die Gaschromatographie selber auch – voraus, dass die Analyten unzersetzt verdampfbar sind, wodurch die GC-MS-Kopplung sich eher für hydrophobe oder durch Derivatisierung hydrophob gemachte, kleine Moleküle eignet [2]. Das Ende der Trennkapillare der GC wird dabei über entsprechende Dichtungen gasdicht in das Ionisationsgehäuse des Massenspektrometers geführt. Das aus der GC-Säule kontinuierlich in das Ionisationsgehäuse austretende Trägergas muss dabei beständig abgepumpt werden, um das Vakuum im Massenspektrometer aufrecht zu erhalten, so dass die Verwendung der heutzutage ohnehin meist verwendeten und mit niedrigen Durchflussmengen betriebenen Kapillarsäulen angebracht ist.

 
Die Ionisationstechniken EI, CI und FI
Bei der Elektronenstoßionisation (EI) emittiert eine Glühkathode Elektronen. Im Ionisierungsgehäuse bildet sich so zwischen Glühkathode und Fänger-Anode ein Elektronenstrahl aus. Passieren Analytmoleküle den Elektronenstrahl, kann ein Elektron aus einer äußeren Schale eines Analytmoleküls herausgeschlagen werden, wodurch Radikalkationen entstehen. Diese sind bei einer standardisierten Elektronenenergie von 70 eV instabil und zerfallen sehr reproduzierbar in charakteristische Fragmentionen, die zur automatisierten Identifizierung von Analyten mittels Spektrenbibliotheken genutzt werden. So lassen sich über GC-MS sehr einfach und sicher bekannte Verbindungen identifizieren und auch quantifizieren. In der häufig verwendeten NIST-Spektrenbibliothek befinden sich aktuell mehr als 250.000 Einträge.
Die Chemische Ionisation (CI) funktioniert analog zu EI, mit der Ausnahme, dass primär nicht die Analytmoleküle selber, sondern Reaktandgasmoleküle ionisiert werden. Als Reaktandgas können z. B. Methan, Isobutan oder auch Ammoniak verwendet werden. Zwischen Reaktandgasionen und Analytmolekülen kommt es anschließend zum Ladungstransfer, in der Regel durch Protonierung (Positivionen-Modus) oder Deprotonierung (Negativionen-Modus). Gerade die negative chemische Ionisation ist äußerst empfindlich. McLafferty und Michnowicz gelang es im Jahre 1992 in einem GC-MS-Experiment mittels negativer chemischer Ionisation eine Menge Octafluornaphtalen nachzuweisen, die in etwa 200.000 Molekülen entsprach [3]. Im Gegensatz zu EI entstehen bei CI deutlich weniger Fragmentionen.
Praktisch gar keine Fragmentierung findet bei der Feldionisation (FI) statt, die eine Variante der Felddesorption (FD) darstellt. Hier befindet sich im Quellengehäuse ein mit Kohlenstoff aktivierter Metallfaden, an den eine Hochspannung angelegt wird. An den Spitzen der feinen Verästelungen der Kohlenstoffdendrite (Whisker) bilden sich sehr hohe Feldstärken aus, die letztlich zu einem Tunneln einzelner Elektronen von Analytmolekülen in unmittelbarer Nähe des Fadens und damit zur schonenden Ionisierung der Analyten führen [4,5]. FI hat aber leider den großen Nachteil, dass es im Vergleich zu EI und CI um etwa drei Größenordnungen weniger sensitiv ist.
 
Ionisierungstechniken zur Kopplung von HPLC, CZE und TLC mit Massenspektrometrie
Bei der Electrospray-Ionisation (ESI) werden die Analyten in Lösung durch eine Kapillare gepresst. Bei angelegter Hochspannung – je nach Flussrate ca. 1.5–5 kV – bildet sich ein Spray aus geladenen Tröpfchen [7]. Durch kontinuierliche Verdunstungsprozesse wird den Tröpfchen Lösungsmittel entzogen, so dass die Ladungsdichte zunimmt. Da gleichnamige Ladungen sich abstoßen, kommt es ab einer gewissen Ladungsdichte zu einer Aufspaltung der Tropfen in kleinere Tröpfchen (Coulomb-Explosion), wodurch sich die Oberfläche vergrößert. Dieser Prozess wiederholt sich, bis am Ende entweder einzelne Ionen aus den verbliebenen Mikrotröpfchen emittiert werden (Ion Evaporation Modell) oder nur noch einzelne solvatisierte Ionen in den Tröpfchen vorliegen, die durch weitere Trocknung vollständig desolvatisiert werden (Charged Residue Modell) [8-10]. Die Ionen werden durch eine Kapillare oder ein kleines Loch in der Frontplatte über elektrische Felder ins Hochvakuum des Massenspektrometers überführt.
Bei der Atmospheric-Pressure-Chemical-Ionization wird die Analytlösung durch ein beheiztes (ca. 300 °C) Keramikrohr gesprüht und so zunächst getrocknet. In einem Lichtbogen, der von einer Corona-Entladungsnadel erzeugt wird, erfolgt eine Primärionisation von „Luft“, die in diesem Fall analog zu CI das Reaktandgas darstellt. In einem zweiten Schritt kommt es zum Ladungstransfer von geladenen „Luftmolekülen“ auf die Analytmoleküle.
Bei der ESI und APCI erfolgt die eigentliche Ionisierung über Protonierung oder Deprotonierung der Analytmoleküle. Geeignete Analyten müssen also protonierbare oder deprotonierbare Gruppen aufweisen. Der Prozess der Ionisierung findet dabei außerhalb des Massenspektrometers statt. Der in Abbildung 2 dargestellte Vergleich der Einsatzbereiche der Methoden zeigt, dass APCI zwar einen geringeren Molekulargewichtsbereich abdeckt, aber besser für unpolarere Verbindungen geeignet ist als ESI. Ein weiterer wichtiger Unterschied ist, dass bei APCI einfach geladene Analytionen entstehen, bei ESI, abhängig von der Molekülmasse, hingegen Mehrfachladungen vorhanden sein können. Als Faustregel kann man sich merken, dass bei der ESI im Schnitt eine Ladung pro 1000 Masseneinheiten transferiert wird. Daraus ergibt sich auch ein durch ESI nahezu unbeschränkter messbarer Molekulargewichtsbereich.

Als weitere Ionisierungstechnik ist die Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) zu nennen. Die Analytmoleküle werden aus Lösung mit einer Matrixlösung gemischt und auf einem „Target“ zur Kristallisation gebracht. Dieses Target wird danach in das Hochvakuum eines entsprechenden Massenspektrometers überführt und dort mit kurzen Laserpulsen bestrahlt, wobei die Matrix die Laserenergie absorbiert, verdampft und dabei eingelagerte Analytmoleküle mitreißt. Die Ionisierung erfolgt durch Protonentransfer zwischen Matrix und Analytmolekülen [11-14]. Aufgrund des Kristallisationsschrittes ist lediglich eine indirekte Kopplung mit Chromatographie möglich, entweder manuell oder über eine entsprechende Robotik, was heute aber kaum noch gemacht wird. MALDI wird heutzutage hauptsächlich für Imaging-Applikationen verwendet, bei der eine mit Matrix besprühte Probe (z. B. Gewebeschnitte) zweidimensional durch den Laserstrahl abgerastert wird und so ortsaufgelöste Massenverteilungen erhalten werden, die zur Erzeugung von Falschfarbenbildern genutzt werden können [15,16].
ESI, APCI und MALDI werden als sogenannte „weiche“ Ionisationstechniken bezeichnet, da keine durch die Ionisierung bedingte Fragmentierung auftritt. Mit ESI lassen sich auch Massenspektren nicht kovalenter Verbindungen erzeugen. Gerade ESI und auch MALDI eignen sich hinsichtlich des abgedeckten Polaritäts- und Molekulargewichtsbereichs ideal für die Bioanalytik (Proteine, Peptide etc.).
 
Weitere Ionsierungstechniken
Neben den hier detaillierter vorgestellten Ionisierungstechniken gibt es noch weitere Techniken mit allerdings bisher geringer Marktdurchdringung, wie z. B. die Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI) oder auch die relativ neue SICRIT Ionenquelle, die sich grundsätzlich auch zur Kopplung von Trenntechniken mit Massenspektrometern eignen. So können über diese beiden Techniken z. B. Gas- und Flüssigkeitschromatographen gekoppelt werden. Ob und in wieweit sich diese Techniken in der Zukunft breiter durchsetzen können muss abgewartet werden.
 
In der Fortsetzung des Artikels liegt der Fokus auf HPLC-MS, CZE-MS und TLC-MS.
 
 
Autoren
Uwe Linne1, Filipp Bezold1, Jan Bamberger1
 
Zugehörigkeiten
1Fachbereich Chemie und Zentrum für Synthetische Mikrobiologie, Philipps-Universität Marburg, Marburg, Deutschland
 
Kontakt 
Dr. Uwe Linne
Fachbereich Chemie und Zentrum für Synthetische Mikrobiologie
Gerätezentrum Massenspektrometrie
Philipps-Universität Marburg
linneu@staff.uni-marburg.de

 

Vortragsreihe zu Massenspektrometrie in der Proteomik

 

Literatur:

[1] Gohlke R. S., McLafferty F. W. (1993), Early gas chromatography/mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. May;4(5):367-71. doi: 10.1016/1044-0305(93)85001-E.

[2] Hübschmann, H.J. (1996), Handbuch der GCMS – Grundlagen und Anwendungen, Verlag Chemie Weinheim

[3] McLafferty F. W., Michnowicz J. A. (1992) State-of-the-art GC/MS, Chemtech, American Chemical Society

[4] Beckey H. D. (1977) Principles of Field Desorption and Field Ionization Mass Spectrometry. Pergamon Press: Oxford

[5] Prokai L. (1990), Field Desorption Mass Spectrometry. Marcel Dekker: New York

[6] Linden, H.B. (2004), Liquid injection field desorption ionization: a new tool for soft ionization of samples including air sensitive catalysts and non-polar hydrocarbons. Eur J Mass Spectrom (Chichester). 10(4):459-68.

[7] Yamashita M., Fenn J. B. (1984). Electrospray ion source. Another variation on the free-jet theme. The Journal of Physical Chemistry. 88 (20): 4451–4459. doi:10.1021/j150664a002

[8] Kebarle P., Verkerk U. H. (2009). Electrospray: from ions in solution to ions in the gas phase, what we know now. Mass Spectrom Rev. 28 (6): 898–917. doi:10.1002/mas.20247

[9] Nguyen S., Fenn J.B. (2007). Gas-phase ions of solute species from charged droplets of solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (4): 1111–7. doi:10.1073/pnas.0609969104

[10] de la Mora Fernandez (2000). Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole's charged residue mechanism. Analytica Chimica Acta. 406: 93–104. doi:10.1016/S0003-2670(99)00601-7

[11] Hillenkamp F., Karas M., Beavis R. C., Chait B. T. (1991). "Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers". Anal. Chem. 63 (24): 1193A–1203A. doi:10.1021/ac00024a002

[12] Karas, M., Krüger R. (2003). Ion Formation in MALDI: The Cluster Ionization Mechanism. Chemical Reviews. 103 (2): 427–440. doi:10.1021/cr010376a

[13] Karas M., Bachmann D., Bahr, U., Hillenkamp F. (1987). Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. Int. J. Mass Spectrom. 78: 53–68. doi:10.1016/0168-1176(87)87041-6

[14] Knochenmuss R. (2006). Ion formation mechanisms in UV-MALDI. The Analyst. 131 (9): 966–86. doi:10.1039/b605646f

[15] Schulz S., Becker M., Groseclose M. R., Schadt S., Hopf C. (2019), Advanced MALDI mass spectrometry imaging in pharmaceutical research and drug development. Curr Opin Biotechnol. 55:51-59. doi: 10.1016/j.copbio.2018.08.003.

[16] Kompauer M., Heiles S., Spengler B. (2017), Autofocusing MALDI mass spectrometry imaging of tissue sections and 3D chemical topography of nonflat surfaces. Nat Methods. (12):1156-1158. doi: 10.1038/nmeth.4433.

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