Kopplungsmethoden in der Massenspektrometrie (Teil 2)

GC-MS, HPLC-MS, CE-MS und TLC-MS

  • Justierung einer Nanospray-Ionenquelle an  einem Orbitrap Velos Pro Massenspektrometer der Firma Thermo Scientific. (© Rolf K. Wegst / Philipps-Universität Marburg.)Justierung einer Nanospray-Ionenquelle an einem Orbitrap Velos Pro Massenspektrometer der Firma Thermo Scientific. (© Rolf K. Wegst / Philipps-Universität Marburg.)
  • Justierung einer Nanospray-Ionenquelle an  einem Orbitrap Velos Pro Massenspektrometer der Firma Thermo Scientific. (© Rolf K. Wegst / Philipps-Universität Marburg.)
  • Abb.: Schematische Darstellung eines CE-MS-ESI-Sprayers und des Funktionsprinzips von CZE.

Im ersten Teil dieses Artikels wurde die GCMS-Kopplung mittels der klassischen Ionisationstechniken EI, CI und FI vorgestellt. Außerdem wurden neben den genannten Ionisierungstechniken die Funktionsprinzipien der jüngeren Ionisierungstechniken Elektrospray-Ionisation (ESI), Atmospheric-Pressure-Chemical-Ionization (APCI) und Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionization (MALDI) beschrieben. Im zweiten Teil soll nun auf die durch diese Techniken ermöglichten Kopplungen mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Kapillarzonenelektrophorese (CZE) und Dünnschichtchromatographie (TLC) eingegangen werden.

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Kopplung von Flüssigkeitschromatographie mit Massenspektrometrie (HPLC- oder LC-MS)
Mit Einführung der Elektrospray-Ionisation (ESI) und der Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) in kommerziellen Geräten vor etwa 30 Jahren wurde auch die Kopplung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (HPLC) mit Massenspektrometern auf einfache Weise möglich [1,2].
Bei ESI und APCI erfolgt die Ionisation außerhalb des Massenspektrometers direkt aus einer Lösung, wodurch sich beide Techniken ideal zur Kopplung mit allen handelsüblichen HPLC- und UPLC-Anlagen (UPLC: Ultra Performance Liquid Chromatography) eignen. Der Ausgang der HPLC-Anlage muss dafür lediglich mit der ESI-Spray-Kapillare verbunden werden. Eluierende Analyten werden „on-the-fly“ ionisiert und ins Massenspektrometer überführt. Die Scan-Raten moderner Massenspektrometer liegen dabei in der Regel deutlich unter einer Sekunde pro Spektrum, meist im Bereich weniger Millisekunden, so dass selbst UPLC-MS-Kopplungen mit kurzen Elutionszeiten und sehr scharfen Peaks kein Problem darstellen. Die Einbindung weiterer zerstörungsfreier Detektoren, wie z. B. UV-Vis- und Fluoreszenzdetektoren ist dabei vor dem Übergang in die Ionenquelle problemlos möglich. Selbst Systeme mit Fraktionssammler, die massenbasiert automatisiert fraktionieren, sind über einen Flow-Splitter und entsprechende Softwareeinbindung zu realisieren und können die (semi-)präparative Reinigung von Stoffen stark vereinfachen.

Von Geräteherstellern werden entsprechende fertige Lösungen angeboten. Einige Hersteller bieten inzwischen sogar Stack-fähige Massenspektrometer als „HPLC-Detektoren“ an, die sehr platzsparend in das HPLC-System integriert werden können und vergleichsweise einfach in der Bedienung sind, so dass eine grundlegende Nutzung für Standardanwendungen auch für massenspektrometrische Laien möglich ist.

 
HPLC-MS-Kopplung in der Proteinanalytik
Kein anderer Bereich wurde durch die Chromatographie-Massenspektrometrie-Kopplung in den vergangenen 20 Jahren so grundlegend revolutioniert wie die Proteinanalytik (Proteomik) in den Lebenswissenschaften. Aufgrund der geringen Probenmengen werden hier Partikel-gefüllte Kapillarsäulen von in der Regel 75 µm Innendurchmesser in speziellen Nano-HPLC-Anlagen eingesetzt, die meist „Bio-inert“ ausgeführt sind. Bio-inert heißt, dass sie sich auch z. B. für die Analyse phosphorylierter Peptide eignen, die die Eigenschaft besitzen, an Edelstahl, genauer Eisen, was in nicht Bio-inerten HPLC-Systemen immer enthalten ist, sehr fest zu binden und sich so der Analyse zu entziehen.
In der Proteomik werden Proteine oder Proteingemische vor der HPLC-MS-Analyse meist proteolytisch gespalten. In der Regel wird dafür die Protease Trypsin eingesetzt, die C-terminal von Lysin- und Argininresten schneidet. Bei einer humanen Zelle geht man etwa von 10.000-18.000 gleichzeitig vorhandenen Proteinen aus [3]. Nimmt man an, dass bei dem tryptischen Verdau im Schnitt pro Protein 30-40 Peptide entstehen, so sind das insgesamt ca. 500.000 Peptide. Hinzu kommen posttranslational modifizierte Varianten und Isoformen, die die Zahl an tatsächlichen Analyten mindestens verdoppeln dürften. Mit der heutigen Gerätetechnik reichen 200 ng einer solchen Peptidmischung aus, um ca. 6.000 der enthaltenen Proteine und ca. 50.000-100.000 Peptide in einem einzigen 90-Minuten-Gradienten zu identifizieren und auch zu quantifizieren [4]. Ohne die nanoHPLC-Kopplung wäre eine gleichzeitige Analytik so vieler Spezies undenkbar. Über 2D-Chromatographie lassen sich diese Zahlen ggf. sogar noch steigern, allerdings zum Preis überproportional längerer Gerätelaufzeiten. Ebenso können mittels Massenspektrometrie Art und Position vorhandener posttranslationaler Modifikationen bestimmt werden [5].
Die Bestimmung der Massen unverdaut chromatographierter, intakter Proteine ist mit einer Genauigkeit von 10 ppm oder besser ebenfalls „on-the-fly“ möglich, wobei auf der Seite der Chromatographie dafür in der Regel Microbore-HPLC-Anlagen verwendet werden. Zu beachten ist lediglich, dass die Eluenten bei Kopplung mit Massenspektrometrie salz- und pufferfrei sein sollten, mit Ausnahme „flüchtiger“ Bestandteile wie z. B. Ammoniumacetat, was z. B. für die Messung nativer Proteine und Proteinkomplexe Verwendung findet [6]. Für die denaturierende LCMS-Analyse pufferhaltiger, wenig komplexer Proteinlösungen finden meist kurze reversed-phase-Vorsäulen zur Online-Entsalzung Verwendung. Einige Hersteller bieten auch spezielle Säulen für diesen Zweck an. Sollen unterschiedliche Proteine chromatographisch getrennt werden, können selbstverständlich auch längere Säulen zum Einsatz kommen. 
 
Kopplung von Kapillarzonenelektrophorese mit Massenspektrometrie (CZE-MS)
Kapillarzonenelektrophorese (CZE) beschreibt die Migration von Molekülen in einer mit Elektrolytlösung gefüllten Kapillare unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes. Typischerweise werden hierbei Quarzglaskapillaren mit einem Innendurchmesser von 25 bis 150 µm und einer Länge von unter einem Meter verwendet. Dies erlaubt Trennspannungen von 100 bis 500 V cm-1 unter Erzeugung von nur geringer Stromwärme [7]. Das Trennprinzip der CZE basiert auf der unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilität von Analyten im Elektrolyten, welche durch die obligatorische Nettoladung und den hydrodynamischen Radius der Moleküle bestimmt wird. Des Weiteren tritt bei der CZE unter geeigneten Oberflächenbedingungen der Kapillare ein elektroosmotischer Fluss (EOF) auf, welcher die Migration der Analyten überlagert. Das charakteristisch flache Flussprofil des EOF trägt im Unterschied zur HPLC nur unwesentlich zur Peakverbreiterung bei und kann genutzt werden, um auch ungeladene oder gegenläufig migrierende Moleküle zum Detektor zu transportieren. Kommerziell sind verschiedene oberflächenmodifizierte Kapillaren verfügbar, welche eine Optimierung des EOF auf die Elektrophoresebedingungen ermöglichen. Die Probeninjektion kann bei der Kapillarelektrophorese entweder elektrokinetisch oder hydrodynamisch erfolgen, wobei nur wenige Nanoliter in die Kapillare injiziert werden. Die geringen Injektionsvolumina sind bei kleinen verfügbaren Probenmengen vorteilhaft, setzen jedoch eine empfindliche Detektion der Analyten voraus. Einen entsprechend hoch sensitiven Messaufbau stellt die Kopplung von Kapillarzonenelektrophorese mit Massenspektrometrie (CZE-MS) dar. Die meistverbreitete Kopplungstechnik nutzt ESI als Ionisationsmethode (CZE-ESI-MS) und wurde in den späten 1980er Jahren entwickelt [8]. Eine Besonderheit der CZE-ESI-MS ist, dass der ESI-Sprayer auch den elektrischen Kontakt für die Elektrophorese herstellt. Deshalb wird bei der klassischen CZE-ESI-MS-Kopplung eine leitfähige Hilfsflüssigkeit mit Flussraten von wenigen µL min-1 über die geerdete Sprayernadel zum Kapillarausgang geführt [9]. Durch die Robustheit und vielseitige Einsetzbarkeit der Technik lässt sich ein breites Spektrum an Analyten erschließen. So können beispielsweise isomere Saccharide bei pH 12 ohne vorherige Derivatisierung getrennt und detektiert werden [10]. Um einer Verdünnung der Analyten vorzubeugen - die Sensitivität von ESI-MS richtet sich im Wesentlichen nach der Analytkonzentration im Eluenten, nicht nach der absolut vorhandenen Stoffmenge -, wurden in den letzten Jahren CZE-MS-Kopplungstechniken kommerzialisiert, welche ohne oder mit bedeutend weniger Hilfsflüssigkeit auskommen und dadurch eine signifikante Sensitivitätssteigerung erreichen [11]. Die CZE-MS eignet sich für die Analyse komplexer Proben und wird wegen ihres orthogonalen Trennprinzips alternativ oder komplementär zur klassischen HPLC-MS verwendet. Aufgrund der für die CZE-MS gut zugänglichen Analyten hat sich die Technik dabei vor allem in der Bioanalytik ein breites Anwendungsgebiet erschlossen und wird unter anderem zunehmend in der Metabolomik, Proteomik und Glykomik eingesetzt.
 
Kopplung von Dünnschichtchromatographie mit Massenspektrometrie (TLC-MS)
Die TLC-MS-Kopplung ist eine Art der indirekten Kopplung, die relativ unbekannt, aber doch für einige Anwendungen sehr interessant ist. Dünnschichtchromatographie ist eine kostengünstige schnelle Chromatographietechnik, die sich leicht parallelisieren lässt. Leider liefern die klassischen Visualisierungsmethoden kaum Informationen zur Identität der Analyten. Wenn dann unbekannte Spots auftauchen beginnt das große Rätseln. Ein Abkratzen der Partikel von der DC-Platte gefolgt von einer händischen Extraktion ist aufwendig und kontaminationsanfällig. Zur Automatisierung dieses Prozesses gibt es ein kommerzielles TLC-MS-Interface zum Anschluss an eine HPLC-Pumpe. Nach der Positionierung der Platte im TLC-Extraktor fährt durch Luftdruck ein Stempel mit Schneidring auf die Platte und umschließt den interessierenden Spot druckdicht. Durch Umschalten eines Ventils wird der HPLC-Fluss dann über den Stempel und die DC-Platte direkt kontaminationsfrei in eine ESI- oder APCI-Quelle eines Massenspektrometers geleitet. Ein Sieb im Stempel verhindert ein Verdriften von Silica-Partikeln in die Ionenquelle. Alternativ lassen sich die DC-Platten mit einer Matrixlösung besprühen und direkt über Imaging-MALDI-MS auslesen [12]. Zu Bedenken ist bei beiden Varianten lediglich, dass viele DC-Färbemethoden die Analyten chemisch verändern oder gar zerstören. Hier sollten jeweils zwei Spuren verwendet werden, wobei eine gefärbt und die andere für Massenspektrometrie verwendet wird. Der Einfachheit halber kann man die DC-Platte vor dem Färben auseinanderschneiden und für die Markierung der interessierenden Bereiche auf der nicht eingefärbten Spur wieder passgenau nebeneinanderlegen. Bei Imaging-MALDI kann auf eine Färbung gänzlich verzichtet werden. Die Spots werden dann über die Imaging-Software visualisiert.
 
Fazit
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die gebräuchlichsten Trenntechniken (GC, HPLC, CZE und TLC) über entsprechende Ionisierungstechniken mit Massenspektrometrie koppelbar sind. Die Kopplung eliminiert vorhandene Limitationen der einzelnen Methoden weitgehend, so dass Chromatographie-Massenspektrometrie Kopplungen aus vielen Bereichen der Analytik nicht mehr wegzudenken sind. Speziell im Bereich Bioanalytik konnte in den vergangenen ca. 20 Jahren mit „Proteomics“ dadurch ein ganz eigenes Arbeitsfeld neu erschlossen werden.
 
 
 
Autoren:
Uwe Linne1, Filipp Bezold1, Jan Bamberger
 
Zugehörigkeit
1Fachbereich Chemie und Zentrum für Synthetische Mikrobiologie, Philipps-Universität Marburg, Marburg, Deutschland
 

Kontakt   
Dr. Uwe Linne

Fachbereich Chemie und Zentrum für Synthetische Mikrobiologie, Gerätezentrum Massenspektrometrie
Philipps-Universität Marburg, Marburg, Deutschland
linneu@staff.uni-marburg.de

Vortragsreihe zu Massenspektrometrie in der Proteomik

Literatur:

[1] Holčapek, Michal; Jirásko, Robert; Lísa, Miroslav (2012). "Recent developments in liquid chromatography–mass spectrometry and related techniques". Journal of Chromatography A. 1259: 3–15. doi:10.1016/j.chroma.2012.08.072

[2] Thomson, Bruce A. (1998-03-01). "Atmospheric pressure ionization and liquid chromatography/mass spectrometry—together at last". Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 9 (3): 187–193. doi:10.1016/S1044-0305(97)00285-7

[3] Wilhelm, M., Schlegl, J., Hahne, H., Gholami, A.M., Lieberenz, M., Savitski, M.M., Ziegler, E., Butzmann, L., Gessulat, S., Marx, H., Mathieson, T., Lemeer, S., Schnatbaum, K., Reimer, U., Wenschuh, H., Mollenhauer, M., Slotta-Huspenina, J., Boese, J.-H., Bantscheff, M., Gerstmair, A., Faerber, F., and Kuster, B. (2014) Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature, 509:582-587. doi: 10.1038/nature13319

[4] Meier F, Brunner AD, Koch S, Koch H, Lubeck M, Krause M, Goedecke N, Decker J, Kosinski T, Park MA, Bache N, Hoerning O, Cox J, Räther O, Mann M. (2018) Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17(12):2534-2545. doi: 10.1074/mcp.TIR118.000900.

[5] Silva AMN, Vitorino R, Domingues MRM, Spickett CM, Domingues P. (2013) Post-translational modifications and mass spectrometry detection. Free Radic Biol Med. 65:925-941. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2013.08.184.

[6] Konermann L. (2017) Addressing a Common Misconception: Ammonium Acetate as Neutral pH "Buffer" for Native Electrospray Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 28(9):1827-1835. doi: 10.1007/s13361-017-1739-3.

[7] Lauer, H. H. & Rozing G. P. (2009) High Performance Capillary Electrophoresis, Agilent Technologies Primer, publication number 5990-3777EN

[8] Olivares, J. A., Nguyen, N. T., Yonker, C. R., & Smith, R. D. (1987). On-line mass spectrometric detection for capillary zone electrophoresis. Analytical Chemistry,      59(8),   1230-1232. https://doi.org/10.1002/1522-2683(200108)22:13<2737::AID-ELPS2737>3.0.CO;2-Z

[9] Rozing G. P., Brunnert H., Aldridge S., & Wenz, C. (2019) CE/MS Principles and Practices, Agilent Technologies Guidebook, publication number 5994-0112EN.

[10] Klampfl, C. W., & Buchberger, W. (2001). Determination of carbohydrates by capillary electrophoresis with electrospray‐mass spectrometric detection.     Electrophoresis, 22(13), 2737-2742.

[11] Stolz, A., Jooß, K., Höcker, O., Römer, J., Schlecht, J., & Neusüß, C. (2018).      Recent advances in capillary electrophoresis‐mass spectrometry: Instrumentation,       methodology and applications. Electrophoresis. https://doi.org/10.1002/elps.201800331

[12] Martin Schürenberg, Detlev Suckau, Beate Fuchs and Jürgen Schiller (2009) Bruker Application Note # MT-94, Direct Read-out of Thin Layer Chromatography (TLC) using MALDI-TOF, https://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/Separations_MassSpectrometry/Literature/literature/ApplicationNotes/MT-94-%20MALDI-TLC.pdf

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