Ligand und Rezeptor

Mit NMR-Spektroskopie molekularen Interaktionen auf der Spur

  • Abb. 1: A) Großes Fragment der DNA-Polymerase I aus T. aquaticus, links im freien Zustand, rechts gebunden an einen DNA-Doppelstrang. B) 1H,13C-HSQC-Spektrum der Methionin-Methylregion. Die Überlagerung der Spektren von freier (schwarz) und DNA-gebundener (rot) Polymerase veranschaulicht die starken Veränderungen sowohl der 1H- als auch der 13C-chemischen Verschiebungen, die durch die Interaktion mit dem DNA-Doppelstrang hervorgerufen werden. Die Abbildungen des Protein-DNA-Komplexes wurden mit Hilfe der PDB-Datensätze 1KTQ und 4KTQ erzeugt)Abb. 1: A) Großes Fragment der DNA-Polymerase I aus T. aquaticus, links im freien Zustand, rechts gebunden an einen DNA-Doppelstrang. B) 1H,13C-HSQC-Spektrum der Methionin-Methylregion. Die Überlagerung der Spektren von freier (schwarz) und DNA-gebundener (rot) Polymerase veranschaulicht die starken Veränderungen sowohl der 1H- als auch der 13C-chemischen Verschiebungen, die durch die Interaktion mit dem DNA-Doppelstrang hervorgerufen werden. Die Abbildungen des Protein-DNA-Komplexes wurden mit Hilfe der PDB-Datensätze 1KTQ und 4KTQ erzeugt)
  • Abb. 1: A) Großes Fragment der DNA-Polymerase I aus T. aquaticus, links im freien Zustand, rechts gebunden an einen DNA-Doppelstrang. B) 1H,13C-HSQC-Spektrum der Methionin-Methylregion. Die Überlagerung der Spektren von freier (schwarz) und DNA-gebundener (rot) Polymerase veranschaulicht die starken Veränderungen sowohl der 1H- als auch der 13C-chemischen Verschiebungen, die durch die Interaktion mit dem DNA-Doppelstrang hervorgerufen werden. Die Abbildungen des Protein-DNA-Komplexes wurden mit Hilfe der PDB-Datensätze 1KTQ und 4KTQ erzeugt)
  • Abb. 2: A) Tetrasaccharid-Struktur, die von einem B. anthracis-spezifischen Antikörper erkannt wird. Die aus dem STD-NMR-Experiment ermittelte Bindungsbeteiligung von Gruppen des Tetrasaccharids sind farblich gekennzeichnet (rot: stark - orange: mittel - gelb: schwach). B) STD-NMR- und Referenz-Spektren des Tetrasaccharids. Gezeigt ist die Region der Methylgruppen.

NMR-Spektroskopie ist die wichtigste Methode zur Strukturaufklärung und Strukturvalidierung in der organischen Chemie. Weit weniger bekannt ist die Leistungsfähigkeit der NMR-Spektroskopie, wenn es darum geht, detaillierte Informationen über die Struktur und Dynamik molekularer Komplexe zu erhalten. Im Folgenden wird ein sehr kurzer Überblick über dieses Gebiet gegeben und gleichzeitig auf umfangreichere Darstellungen in der Literatur verwiesen [1 - 3].

Grundsätzlich lassen sich die Methoden nach ihrer Perspektive einordnen, aus der die Wechselwirkung beobachtet wird. Bei Rezeptor-basierten Experimenten werden die NMR-Spektren des üblicherweise relativ großen (Bio-) Macromoleküls (MW >ca. 2 - 10 kDa) beobachtet, die sich durch die Interaktion mit einem Bindungspartner verändern. Auch die NMR-Spektren bzw. mittels NMR messbare Parameter von Liganden niedrigen Molekulargewichts (< 2 kDa) sind empfindlich für molekulare Interaktionen. Darauf abzielende Experimente werden als Ligand-basierte Methoden bezeichnet.

Rezeptor-basierte Interaktionsstudien
Bindet ein Ligand an seinen Rezeptor, so unterliegen die an der Interaktion beteiligten Gruppen des Rezeptors potentiell einer ganzen Reihe von Veränderungen, die sich NMR-spektroskopisch aufspüren lassen. Ringstromeffekte aromatischer Gruppen des Liganden und geladene oder stark polarisierte Gruppen beeinflussen die chemischen Verschiebungen NMR-aktiver Kerne des Rezeptors in unmittelbarer Nähe zum gebundenen Liganden. Darüber hinaus bewirkt die Bindung eines Liganden u. U. kleine, jedoch signifikante Änderungen in der Konformation des Rezeptors (induced fit), bzw. in den Besetzungsverhältnissen seines konformationellen Ensembles (conformational selection). Auch diese geometrischen Störungen wirken sich auf die chemischen Verschiebungen des Rezeptors aus.

Zusammengenommen beobachtet man also Signalverschiebungen des Rezeptors bei Zugabe seines Liganden, wobei die Ausprägung - konzentrationsabhängige Verschiebung, Erscheinen eines neuen Signalsatzes oder das komplette Verschwinden von Signalen durch Austauschverbreiterung - sehr stark von der Affinität und Bindungskinetik abhängt.

Auf diese Weise lässt sich eine Bindungstasche lokalisieren, und man kann feststellen, ob verschiedene Liganden die gleiche Bindestelle besetzen. Zusätzlich sind Aussagen über die Veränderung der Dynamik des Rezeptors möglich, die durch die Bindung des Liganden verursacht werden.

Aufklärung durch 15N-Isotopenmarkierung
Die große Mehrzahl an Rezeptor-basierten Ligandbindungsstudien beschreibt die Interaktion anhand der Signalverschiebungen im 1H,15N-HSQC-Spektrum, das die chemische Verschiebung von Protonen mit derjenigen eines direkt gebundenen 15N-Kerns korreliert. In diesem Spektrum besitzt im Idealfall jede Aminosäure (außer Prolin) ein individuelles Kreuzsignal, das als Spin-Sonde für Ligand-induzierte Veränderungen dienen kann.

Bei Herstellung des Proteinrezeptors durch Expression in E. coli ist die Markierung mit 15N normalerweise problemlos möglich. Außerdem sind die experimentellen Strategien zur sequenziellen Zuordnung der Resonanzen für kleine bis mittelgroße Proteine (MW < 25 kDa) inzwischen sehr gut etabliert. Bei größeren Rezeptoren steigen Aufwand und Kosten deutlich an. Mehr Aminosäuren ergeben mehr Signale, d. h. komplexere Spektren und stärkere Signalüberlappung. Noch ungünstiger ist allerdings, dass gleichzeitig die Linienbreiten immer größer werden, was die Signalüberlagerung verschlimmert und das Signal-zu-Rausch-Verhältnis mindert. Ausweg bietet hier die Trosy-Technik, die auch noch bei sehr großen Proteinen (> 100 kDa) scharfe Amid-NH-Korrelationen liefert, jedoch nur, wenn das Protein mit vollständig deuterierten Seitenketten, eingesetzt wird.

Probleme durch zu viele Kreuzsignale
Dass jede Aminosäure ein NH-Kreuzsignal hervorruft, kann sich bei größeren Proteinen als Nachteil herausstellen, da die Signalzuordnung häufig langwierig ist und Änderungen der chemischen Verschiebungen durch Signalüberlappung übersehen oder nicht zweifelsfrei zugeordnet werden können. Hier kann es sich anbieten, an anderer Stelle spezifische Markierungen anzubringen. Das in Abbildung 1 gezeigte Beispiel illustriert dies anhand des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I aus T. aquaticus, eines Enzyms, das mit 63 kDa schon sehr groß nach NMR-Standards ist [4]. Um Änderungen in Struktur und Dynamik aufzudecken, die durch Bildung verschiedener bi- und ternärer Komplexe ausgelöst werden, wurden hier spezifisch 13C-Markierungen der ε-Methylgruppen von Methionin-Resten eingeführt. Durch die hohe interne Beweglichkeit der Methionin-Seitenkette sowie die Rotation der Methylgruppe weisen diese Gruppen relativ lange transversale Relaxationszeiten auf, sodass auch bei einem Protein dieser Größe scharfe Linien erhalten werden - und das auch ohne Perdeuterierung. Die Zuordnung der einzelnen Signale erfolgte hier über Punktmutanten, bei denen jeweils ein Methoninrest durch Alanin ersetzt worden war.

Ligand-basierte Interaktionsstudien
Die im Folgenden vorgestellten Experimente liefern komplementäre Informationen zu den Rezeptor-basierten Studien. Dabei ist besonders bemerkenswert, dass die Ligand-basierten Experimente häufig auch dann noch sehr gut funktionieren, wenn Rezeptor-basierte Ansätze zum Scheitern verurteilt sind, z. B. wenn das Makromolekül nicht in ausreichender Konzentration in Lösung zu erhalten oder eine geeignete Isotopenmarkierung nicht zu erreichen ist. Leider treten diese Probleme häufig bei besonders interessanten Rezeptoren auf, z. B. bei Membranproteinen, sehr großen Rezeptorkomplexen oder posttranslational modifizierten Proteinen.

Ligand-basierte Experimente sind von diesen Einschränkungen nicht oder deutlich weniger betroffen, weil es keine Größenlimitierung für den makromolekularen Rezeptor gibt und dieser auch nicht isotopenmarkiert vorliegen muss. Die sehr hohe Empfindlichkeit dieser Methoden erlaubt es außerdem, den Rezeptor in sehr viel niedrigeren Konzentrationen einzusetzen, je nach Bindungskinetik und Experiment 10 - 1000-fach niedriger als bei entsprechenden Rezeptor-basierten Studien, was wiederum deutlich niedrigere Kosten zur Folge hat und eventuelle Löslichkeitsprobleme umgeht. Voraussetzung für eine erfolgreiche Anwendung dieser Methodik ist allerdings, dass ein ausreichend schneller Austausch des Liganden zwischen dem gebundenen und dem freien Zustand stattfindet, sodass Informationen über den gebundenen Zustand in den freien Zustand des Liganden übertragen werden, um dort detektiert zu werden. Unter diesen Bedingungen kann ein deutlicher Überschuss des Liganden (10 - 1000-fach) eingesetzt werden, wodurch die Empfindlichkeit der Methode zusätzlich erhöht wird.

Weitere Methoden
Eine Methode, die sich durch besondere Empfindlichkeit und Robustheit auszeichnet und daher auch in der pharmazeutischen Industrie in der Leitstruktursuche und dem Fragment-basierten Wirkstoffdesign breite Anwendung gefunden hat, ist die saturation transfer difference (STD) NMR-Spektroskopie [5]. Hierbei wird ausgenutzt, dass sich die Resonanzen eines makromolekularen Rezeptors selektiv sättigen, d. h. „auslöschen" lassen. Diese Sättigung verteilt sich dann über einen als Spin-Diffusion bezeichneten Prozess über den gesamten Rezeptor und auf Liganden, die mit ihm in Interaktion stehen. Dabei sind Gruppen des Liganden, die einen intensiven Kontakt zur Bindetasche haben, besonders stark betroffen und zeigen schlussendlich im STD-NMR-Spektrum die intensivsten Signale.

Bei strukturbiologischen Fragestellungen erweist sich diese Epitop-Charakterisierung als besonders attraktiv. In Abbildung 2 ist gezeigt, wie mit Hilfe von STD-NMR das Epitop eines Tetrasaccharids bestimmt wurde, das von einem Anthrax-spezifischen, monoclonalen Antikörper erkannt wird [6]. Dieser Antikörper bindet mit beachtlicher Affinität (KD =9.1 mM) an ein ungewöhnlich großes Kohlenhydrat-Epitop und könnte für diagnostische Anwendungen attraktiv sein.

Bemerkenswert ist hier die Möglichkeit, trotz der z. T. starken Signalüberlagerung von fast allen Protonen individuelle STD-Effekte quantifizieren zu können (siehe Abb. 2B). Bei noch stärker überlagerten Resonanzen können 2D-STD-Tocsy-Spektren einen Ausweg darstellen. Allerdings ist die quantitative Auswertung solcher Spektren nicht trivial und erfordert den Einsatz quantenmechanischer Simulationsverfahren [7].
Die Informationen, die aus STD-NMR-Experimenten erhalten werden, können dann genutzt werden, um Liganden in die Bindungstasche von Rezeptoren zu docken. Rigoros kann dies mit dem (recht aufwändigen) Corcerma-ST Verfahren erreicht werden [8]. Tatsächlich haben sich auch Docking-Ansätze, die die NMR-Informationen approximativ verwenden, als sehr leistungsfähig erwiesen [9].

Auf der experimentellen Seite zeigen neue Entwicklungen, dass die Informationen aus dem STD-NMR-Verfahren noch verbessert werden können, wenn die Relaxationszeiten der Ligandprotonen einkalkuliert werden [10]. In bestimmten Fällen zeigt sich im Hinblick auf die Epitop-Charakterisierung eine neue Methode überlegen, die direkt den Einfluss der Rezeptorprotonen auf die Relaxationszeiten der Ligandprotonen als Messgröße verwendet [11].

Eine ganze Reihe weiterer Ligand-basierter Verfahren liefern ähnliche oder ergänzende Informationen zum STD-NMR-Experiment. Das Waterlogsy-Experiment kann Vorteile bei stark hydratisierten Rezeptoren aufweisen [12]. Mit Hilfe von trNOEs lässt sich die bioaktive Konformation des Liganden bestimmen. Die Inpharma-Methode erlaubt es, den relativen Bindungsmodus verschiedener Liganden in derselben Bindungstasche zu bestimmen [13].

Zusammenfassung
Im Idealfall ist es durch Kombination von Ligand- und Rezeptor-basierten NMR-Experimenten möglich, einen sehr umfassenden Einblick in die Wechselwirkung zwischen Rezeptoren und ihren Liganden zu erhalten. Diese Informationen können dann Ausgangspunkt für die Entwicklung biologisch aktiver Substanzen sein.

Referenzen
[1] Meyer B. & Peters T.: Angew Chem Int Ed 42, 864-890 (2003)
[2] Homans S.W.: Angew Chem Int Ed 43, 290-300 (2004)
[3] Carlomagno T.: Annu Rev Biophys Biomol Struct 34, 245-266 (2005)
[4] Holzberger B. et al.: ChemBioChem 13, 635-639 (2012)
[5] Mayer M. & Meyer B.: Angew Chem Int Ed 38, 1784-1788 (1999)
[6] Oberli M. et al.: JACS 132, 10239-10241 (2010)
[7] Lukzen N. & Möller H.M.: Appl Magn Reson 41, 325-336 (2011)
[8] Krishna N.R. & Jayalakshmi V.: Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 49, 1-25 (2006)
[9] Korb O. et al.: ChemMedChem 5, 1001-1006 (2010)
[10] Kemper S. et al.: J Magn Reson 203, 1-10 (2010)
[11] Y. Mizukoshi et al.: Angew. Chem. International Edition 51, 1362-1365 (2012)
[12] Dalvit C. et al.: J Biomol NMR, 21, 349-359 (2001)
[13] Sanchez-Pedregal V. M. : Angew Chem Int Ed Engl, 44, 4172-4175 (2005)

Kontaktieren

Universität Konstanz - Biomolekulare NMR-Spektroskopie
Jacob-Burckhardt-Str. 35
78464 Konstanz

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