Massenspektrometrie - Zusatzinformationen

Zusatzinformationen zum Beitrag Massenspektrometrie aus der GIT 7 2012

  • Analyse eines Peptidgemisches mit einem Q-ToF(A und B) und Orbitrap (C und D) ESI-Massenspektrometer.Analyse eines Peptidgemisches mit einem Q-ToF(A und B) und Orbitrap (C und D) ESI-Massenspektrometer.

Bioanalytische Massenspektrometrie hat sich in den letzten 20 Jahren zu einer Schlüsseltechnologie in den Lebenswissenschaften entwickelt. Dies führte zur Etablierung einer neuen Forschungsrichtung, der Proteomik. Per Definition bezeichnet Proteomik die Erforschung des Proteoms, der Gesamtheit aller in einem bestimmten Zustand einer Zelle oder eines Organismus vorhandenen Proteine.

Zusätzliche Erläuterungen zur Abbildung 1

Die Peptidmischung wird mittels nano Hochleistungsflüssigkeitschromatographie getrennt und direkt am Eingang des Massenspektrometers durch sogenanntes Elektrospray ionisiert (ESI).

A: In einem Q ToF (Quadrupol Time of Flight) Instrument wird zunächst die Molekularmasse (korrekt: Masse zu Ladungsverhältnis) des Peptids (sog. Vorläuferion) abhängig von seiner Flugzeit im Hochvakuum bestimmt. Es wird ein sogenanntes „MS"-Spektrum erstellt.

B: Zur Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Peptides, wird das entsprechende Vorläuferion in einem Ionenfilter (Isolationsquadrupol, 1. Quadrupol) von allen anderen Peptiden, die ein anderes Masse zu Ladungsverhältnis haben, abgetrennt und gelangt in die sogenannte Kollisionszelle (2. Quadrupol). Dort herrscht z. B. ein leicht erhöhter Druck eines Inertgases wie Argon, Helium oder Stickstoff. Stöße des Peptides mit dem Gas führen zu einem Bruch der Peptidbindung. Die Peptidfragmente werden in den Flugzeit-Bereich geleitet und ein Spektrum der unterschiedlich schweren Fragmente des Peptides wird wie oben beschrieben gemessen. Das Fragmentspektrum wird auch als „MSMS" bezeichnet.

C: In einem Orbitrap-Massenspektrometer wird nicht aus der Flugzeit eines Peptides/Vorläuferion dessen Masse zu Ladung bestimmt, sondern aus dessen Frequenz, mit der sich das Vorläuferion/Peptid in einem elektrischen Feld um eine axiale spindelförmige Elektrode (sogenannter Orbitrap Analysator) bewegt.

Diese Art der Bestimmung von Masse zu Ladung ist hochgenau. Mittels Fourier Transformation können auch unterschiedliche Frequenzen von mehreren verschiedenen Vorläuferionen (Peptiden), die sich gleichzeitig um die Elektrode bewegen, in deren genauen Masse zu Ladungsverhältnisse umgewandelt werden. Bevor die Vorläuferionen in den Orbitrap-Analysator gelangen, werden sie zunächst in einer Ionenfalle gesammelt, dann über eine zweite Ionenfalle (C trap) gebündelt und orthogonal in den Orbitrap-Analysator weitergeleitet.

D: Das Orbitrap Massenspektrometer verfügt über mehrere Fragmentierungsmöglichkeiten von Peptiden, CID (collision induced dissociation) und HCD (higher energy collision induced dissociation). Im CID Modus werden nach der genauen Molekulargewichtsbestimmung im Orbitrap-Analysator (siehe oben) einzelne Peptide in der Ionenfalle selektiert, beschleunigt und durch Stöße mit Helium fragmentiert. Die Massen der Fragmente werden von den beiden Detektoren der linearen Ionenfalle gemessen. Alternativ dazu können selektierte Peptide auch in die HCD-Kollisionszelle weitergeleitet werden, wo die Fragmentierung durch Stöße mit Stickstoff Molekülen erfolgt. Die Fragmentionen werden anschließend in die Orbitrap geleitet, wo die unterschiedlichen Massen der Fragmente akkurat bestimmt werden.

CID hat den Vorteil, dass die Aufnahme der Fragmentspektren sehr schnell, fast parallel zur Bestimmung des Molekulargewichts der Peptide im Orbitrap-Analysator erfolgen kann. HCD hat den Vorteil, dass auch sehr kleine Fragmentmassen (< 200 Da) gemessen werden können und das die Qualität der Fragmentspektren höher ist, als solche die mittels CID erzeugt wurden.

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