Mehr Gewissheit in der Flüssigchromatographie

Zweidimensionale Chromatographie zur Lösung komplexer Trennprobleme

  • Abb. 1: Prinzip der 2D-Trennung. In der ersten Dimension coeluirende Komponenten werden in der zweiten Dimension getrennt.Abb. 1: Prinzip der 2D-Trennung. In der ersten Dimension coeluirende Komponenten werden in der zweiten Dimension getrennt.
  • Abb. 1: Prinzip der 2D-Trennung. In der ersten Dimension coeluirende Komponenten werden in der zweiten Dimension getrennt.
  • Abb. 2: Realisierung von 2D-Trennungen mit Probensammelventil ohne Umbau unter ausschließlicher Verwendung eines 1-dimensionalen chromatographischen Systems.
  • Abb. 3: Einfluss der Fraktionsposition auf die Quantifizierung von unvollständig aufgelösten Peaks der ersten Dimension.
  • Abb. 4: Schematischer Aufbau eines 2D Systems (links). Konfiguration eines 8-Port 2-Wege Transferventiles bei 2D-Messungen.
  • Abb. 5: 2D-Chromatogramm eines Propfproduktes entstanden durch Pfropfung von Polystyrol auf PMMA. Blau: PMMA-Ketten, Rot: Polystyrolketten.
  • Tabelle 1: Gegenüberstellung der Vor- und Nachteilen unterschiedlicher Ansätze zur 2D LC

Die zwei-dimensionale Flüssigchromatographie erfährt aktuell eine starke Nachfrage. Sie ist besonders geeignet um komplexe Mischungen zu charakterisieren, die durch eindimensionale Analysentechniken nur schwierig oder gar nicht zu trennen sind, und um sicherzustellen, dass Peaks reinen Komponenten entsprechen. Der vorliegende Artikel beschreibt verschiedene Ansätze zur Realisierung von 2D-Trennungen und belegt an einem Beispiel den zusätzlichen Informationsgewinn. 

Wozu zweidimensionale Chromatographie?
In den letzten Jahren ist ein steigender Trend zur zweidimensionalen Flüssigchromatographie (2D-LC) zu verzeichnen. Der Grund hierfür ist die stetig wachsende Anzahl komplexer Trennprobleme, in welchen eine sehr große Anzahl an Substanzen getrennt werden müssen. Zur Lösung derartiger Fragestellungen müssen die verwendeten chromatographischen Trennverfahren sehr hohe Peakkapazitäten aufweisen. Die Peakkapazität gibt dabei die Anzahl an Peaks an, die sich mit einer bestimmten Auflösung noch trennen lassen. Ein Beispiel für derartig komplexe Trennprobleme ist der Bereich der Proteomik, in welchem sehr viele unterschiedliche Proteine getrennt werden müssen. Eine Möglichkeit hohe Peakkapazitäten zu realisieren, liegt in der Verwendung von langen Trennsäulen mit sehr geringer Partikelgröße. Damit lassen sich im Idealfall Peakkapazitäten von einigen Hundert erzielen. Die geringeren Partikeldurchmesser führen allerdings zu sehr hohen Gegendrücken, wodurch trotz Einsatz von U(H)PLC-Systemen die maximal einsetzbaren Säulenlängen und damit auch die maximal erzielbaren Peakkapazitäten beschränkt sind.

Ein gänzlich anderer Ansatz wird in der 2D-LC verfolgt, bei der eine Probe nacheinander auf zwei unterschiedlichen Säulen getrennt wird [1]. Dies ähnelt der Entwicklung von Dünnschichtplatten in zwei Richtungen. Die theoretische Peakkapazität ergibt sich in diesem Fall als Produkt der Peakkapazitäten der beiden Einzeltrennungen [2].

Dadurch lassen sich - auch bei normaler Trennleistung in der zweiten Dimension - erheblich mehr Peaks trennen, als mit eindimensionalen Trennverfahren [3, 4].
Im Bereich der Polymercharakterisierung, bei der man es aufgrund der statistischen Prozesse während der Polymerisationen immer mit einer sehr hoher Anzahl sehr ähnlicher, aber nicht identischer Ketten zu tun hat, hat sich die 2D-LC schon lange bewährt.

Was ist zweidimensionale Chromatographie?
Bei der 2D-LC werden Fraktionen einer ersten chromatographischen Trennung (z.

B. Umkehrphasenchromatographie) einer zweiten chromatographischen Trennung unter anderen Trennbedingungen (z. B. Normalphasenchromatographie) unterzogen. Peaks, die aufgrund mangelnder Peakkapazitäten in der ersten Dimension co-eluieren, können so nach der zweiten Trennung voneinander separiert werden (Abb. 1).

2D-LC-Trennungen lassen sich online oder offline realisieren. Weiterhin zu unterscheiden ist, ob nur einzelne Fraktionen oder alle Fraktionen der ersten Dimension in der zweiten Dimension analysiert werden [5].

Die umfassende oder comprehensive 2D-LC bietet dabei die höchste Analysensicherheit. Unter comprehensive 2D-LC versteht man 2D-Trennungen, bei denen alle Fraktionen der ersten Dimension zu gleichen Anteilen in die zweite Dimension überführt und dort analysiert werden. Weiterhin wird gefordert, dass die Auflösung der ersten Dimension weitgehend erhalten bleibt [6]. Theoretische Überlegungen zeigen, dass zur Erfüllung des zweiten Kriteriums etwa 2-4 Schnitte pro Peak erforderlich sind. Comprehensiveness wird durch ein Multiplikationszeichen (x) zwischen den gekoppelten Trennverfahren symbolisiert. So würde RP x CE eine 2D-Trennung symbolisieren, bei welcher alle Fraktionen einer Umkehrphasenseparation zu gleichen Anteilen und ohne wesentlichen Auflösungsverlust mittels Kapillarelektrophorese analysiert werden.

Im Gegensatz dazu symbolisiert ein Bindestrich „Hyphen“ (-) lediglich eine direkte (online) Kopplung (Hyphenation), wie sie
z. B. bei Verwendung eines UV-Diodenarray- oder eines Lichtstreudetektors vorliegt.

Realisierung zweidimensionaler chromatographischer Trennungen
Heart-cutting zur Überprüfung der Peakreinheit
Sollen nur einige wenige Fraktionen in der zweiten Dimension analysiert werden, weil nur für wenige Peakpaare in der ersten Dimension eine unvollständige Trennung erzielt wurde, bietet sich das Heart-cutting unter Verwendung eines Probenspeicherventils an. Dieses wird nach der Trennsäule installiert. In den Speicherschleifen des Ventils werden die zu analysierenden Fraktionen der ersten Trennung „geparkt“ und hermetisch abgeschlossen, wodurch die Konzentrationen der Fraktionen erhalten bleiben. Anschließend wird das Sammelventil in den Flussweg der zweiten chromatographischen Dimension integriert und der Inhalt der Schleifen sukzessive in der zweiten Dimension analysiert. Die in Abbildung 2 dargestellte Lösung ermöglicht eine Realisierung von 2D-Trennungen mit nur einem Flüssigchromatographen und ohne Säulenumbau. In der Sammelstellung wird die  Proben mittels eines Probengebers oder eines manuellen Aufgabesystems injiziert und durchfließt nacheinander Ventil 1, Ventil 2, Säule und Probensammelventil. Wird das Probensammelventil nicht betätigt, lässt sich diese Konfiguration nutzen, um die Methode für die erste chromatographische Dimension zu entwickeln. Nachdem die Fraktionen gesammelt wurden, wird durch Schalten von Ventil 2 die Säule für die zweite chromatographische Trennung in den Flussweg geschaltet. Gleichzeitig wird durch Schalten von Ventil 1 das Probensammelventil zwischen den Probengeber und Ventil 2 geschaltet. Wird nun aus dem Probensammelventil eine Fraktion in den Flussweg gebracht, so durchfließt sie nacheinander Ventil 2, die Säule der zweiten Dimension, Ventil 1 und schließlich den Detektor.

Bei der Verwendung eines Probensammelventils ist die Anzahl der in der zweiten Dimension analysierbaren Fraktionen durch die Anzahl der Speicherschleifen beschränkt. Somit kann keine umfassende (comprehensive) 2D Trennung erfolgen. Zudem beeinflusst der Zeitpunkt, bei dem der Peak der ersten Dimension geparkt wird, die Zusammensetzung von unzureichend aufgelösten Peaks (Abb. 3). Daher ist auch keine Quantifizierung der Probenzusammensetzung möglich.

Offline-Trennung via Fraktionssammlung
Ein anderer Ansatz zur Realisierung von 2D-Trennungen kann die Verwendung eines Fraktionssammlers sein. Die gewünschten Fraktionen werden nach der ersten chromatographischen Trennsäule gesammelt und anschließend in Probenvials überführt.  Diese können nun mit dem gleichen (z. B. nach Wechsel der Trennsäule) oder einem anderen Chromatographen analysiert werden.

Bei Verwendung eines Fraktionssammlers ist eine wiederholte Fraktionierung möglich. Hierdurch, sowie durch die Möglichkeit die Probe einzuengen, kann die durch die Fraktionierung vorgegebene Probenkonzentration für die zweite Dimension erhöht und somit die Detektion erleichtert werden.

Ein weiterer Vorteil des offline Arbeitens ist die Möglichkeit einen Lösungsmittelwechsel vorzunehmen. Dadurch lassen sich Probleme einer unzureichenden Probenadsorption aufgrund eines ungeeigneten Lösungsmittels verhindern. Schließlich wird die wechselseitige Abhängigkeit der Flussraten und Analysenzeiten (s. u.) in beiden Dimensionen aufgehoben. Somit ist es möglich auch in der zweiten Dimension unter Verwendung längerer Analysenzeiten optimale Auflösungen zu realisieren.

Nachteilig ist jedoch das manuelle Probenhandling, welches, verglichen mit der automatisierten online 2D-LC, höhere Kosten verursacht und die Fehleranfälligkeit erhöht. Sollen nicht nur Komponenten getrennt und identifiziert, sondern auch Eigenschaftsprofile (wichtig bei polydispersen Proben wie z. B. Makromolekülen) ermittelt werden, ist dieses Verfahren in der Regel nicht geeignet.

Umfassende zwei-dimensionale Chromatographie
Eine umfassende und damit vollständig quantifizierbare automatisierte 2D-Trennung lässt sich mithilfe eines Transferventils erreichen, mit dem die beiden Trennsysteme online miteinander gekoppelt werden. Das Transferventil wird hinter der Trennsäule der ersten Dimension installiert (Abb. 4, links). Der erste Chromatograph besteht aus Pumpe, Probenaufgabesystem, Trennsäule und Transferventil. Davor oder dahinter kann (muss aber nicht) ein zusätzlicher Detektor installiert werden. Dies ist sinnvoll, um das erste chromatographische System ohne Umbaumaßnahmen als eigenständiges Chromatographiesystem, z. B. für die Methodenentwicklung in der ersten Dimension, nutzen zu können. Das zweite chromatographische System wird gebildet aus einer Pumpe, dem Transferventil, welches das Injektionssystem für die zweite Dimension darstellt, gefolgt von Trennsäule und Detektor.

Das Transferventil überführt die Fraktionen automatisiert aus der ersten in die zweite Dimension. Hierzu ist es mit zwei identischen Probenschleifen ausgerüstet (Abb. 4 rechts). Während der Effluent der ersten Dimension die erste Probenscheife befüllt, spült die Pumpe der zweiten Dimension den Inhalt der zweiten Schleife auf die Trennsäule der zweiten Dimension, wo dieser analysiert wird. Nach erfolgter Analyse wird das Transferventil in die zweite Position geschaltet. Hierdurch wird nun der Inhalt der ersten Probenschleife in die zweite Dimension injiziert, während die zweite Probenschleife aus der ersten Dimension gefüllt wird. Durch wiederholtes Schalten ergeben sich so Chromatogramme in der zweiten Dimension, die über Ihre Injektionszeiten mit dem Elutionsvolumen der ersten Dimension definiert verknüpft sind.

Um einen vollständigen Transfer aller Probenkomponenten aus der ersten in die zweite Dimension zu gewährleiten, muss die Flussrate so auf das Schleifenvolumen und die Analysenzeit der zweiten Dimension abgestimmt werden, dass die Schleife in der Analysenzeit der zweiten Dimension nicht überfüllt wird [7]. Dies kann erreicht werden, indem in der ersten Dimension eine sehr niedrige und in der zweiten Dimension eine möglichst hohe Flussrate verwendet wird. Selbstverständlich erlaubt es der in Abbildung 4 gezeigte Aufbau auch Heart-cuts zu realisieren, also nur einige selektierte Fraktionen der ersten Dimension in der zweiten Dimension zu analysieren.

Wird im „comprehensive mode“ gearbeitet, d. h. werden von allen Fraktionen identische Anteile in die zweite Dimension überführt, so lassen sich auch Peakquantifizierungen vornehmen. Eine Quantifizierung aus den Chromatogrammen nur einzelner in die zweite Dimension injizierter Fraktionen ist hingegen inkorrekt, da die übertragene Probenmenge und bei unvollständige getrennten Peaks selbst die relativen Anteile der Komponenten von der Lage der Fraktion im Peak der ersten Dimension beeinflusst werden, wie in Abbildung 3 gezeigt ist.

Die Vor- und Nachteile der drei unterschiedlichen Verfahren sind in Tabelle 1 gegenübergestellt.

Informationsgewinn durch zweidimensionale chromatographische Trennungen
Die 2D-LC erlaubt es Trennungen zu erzielen, die mit eindimensionalen Trenntechniken nicht erreicht werden können. In der Polymerforschung finden sich eine Vielzahl von Anwendungen von 2D-Trenntechniken. Der Grund liegt in den mehrdimensionalen und kontinuierlichen molekularen Eigenschaftsverteilungen, die in modernen Makromolekülen anzutreffen sind. Zunächst unterscheiden sich die einzelnen Polymerketten in der Kettenlänge. Wird mehr als nur eine Art an Monomerbausteinen zur Herstellung des Polymeren verwendet (Copolymer), so unterscheiden sich die einzelnen Ketten zusätzlich in ihrer chemischen Zusammensetzung. Schließlich können auch unterschiedliche Arten der Verknüpfung der Polymerketten (Verzweigungen, Zyklen, etc.) vorliegen. Im Folgenden soll der Informationsgewinn der 2D-LC am Beispiel eines Pfropfcopolymeren dargestellt werden. Das Pfropfcopolymer wurde hergestellt, indem auf ein Rückgrat aus Poly(methylmethacrylat) (PMMA) mit breiter Molekulargewichtsverteilung Ketten aus engverteiltem Polystyrol aufgepfroft wurden.

Da Pfropfreaktionen statistische Prozesse darstellen, können neben dem gewünschten Pfropfcopolymer sowohl unbepfropfte PMMA- als nicht umgesetzte Polystyrolketten im Produkt vorliegen. Zusätzlich unterscheiden sich die Pfropfcopolymerketten bezüglich ihrer Molmasse und dem Pfropfungsgrad. 

Der 2D Contourplot eines Pfropfproduktes ist in Abbildung 5 wiedergegeben. Es lassen sich klar unterschiedliche Elutionsbereiche erkennen, die anhand ihres chromatographischen Verhaltens definierten Spezies zugeordnet werden können. Weil umfassende 2D-Analyse durchgeführt wurde (comprehensive mode), ist auch eine Quantifizierung der einzelnen Fraktionen möglich (Gehaltsbestimmung).

Da im vorliegenden Fall die Trennung in der zweiten Dimension mittels Größenausschlusschromatographie (GPC/SEC) erfolgte, lassen sich den unterschiedlichen eluierenden Komponenten auch Molekulargewichtmittelwerte und Dispersitäten zuordnen.

Während bei der 2D-Trennung eine Separation sowohl nach der Zusammensetzung als auch nach der Molekülgröße erfolgt, wird bei einer reinen GPC/SEC-Trennung nur aufgrund der Molekülgröße in Lösung getrennt. Bei der GPC/SEC der vorliegenden Produktmischung kommt es daher zur gleichzeitigen Elution von Molekülen identischer Größe, aber unterschiedlicher Zusammensetzung und Topologien. So eluieren z. B. bei einem Elutionsvolumen von 7.5 mL neben unumgesetztem PMMA hoher Molmasse sowohl hoch als auch schwach bepfropfte Copolymere. Bei einem Elutionsvolumen von ca. 9 mL kommt es zur Coelution des Polystyrol-Edukts mit niedermolekularen PMMA-Ketten und nur schwach bepfropften Copolymeren niederer Molmasse. Alleine mittels Größenausschlusschromatographie lässt sich die Zusammensetzung der komplexen Polymermischung nicht aufklären. Auch die Verwendung molmassensensitiver Detektionstechniken, wie GPC/SEC mit Lichtstreu- oder Viskositätsdetektion bringt hier keine Vorteile.

In einem reinen Gradientenlauf (Polmyer HPLC) kommt es hingegen zur Coelution von Pfropfcopolymeren unterschiedlicher Propfgrade und Molmassen.
Nur die durch die Kopplung zweier chromatographischer Trennungen erzielte höhere Peakkapazität erlaubt es somit auch diese Copolymere umfassend zu charakterisieren.

Quo Vadis zweidimensionale Chromatographie?
Die Leistungsfähigkeit zweidimensionaler Trennungen ist unbestritten. Dass die Methode, auch zur Sicherstellung des Trennungserfolgs bezüglich Peakreinheit, in immer mehr Bereichen eingesetzt wird ist eine erfreuliche Entwicklung in Richtung besserer Analytik.

Die aktuellen Entwicklungen im Bereich der 2D-LC befassen sich vor Allem mit der Verkürzung der Analysenzeiten durch Verwendung von Säulen geringerer Dimension und kleinerer Partikel. Auch die Charakterisierung der Fraktionen durch intelligente Detektionsmethoden, wie zum Beispiel Massenspektrometrie, bleibt sicherlich Gegenstand zukünftiger Forschung.

Autoren
Wolfgang Radke1, Peter Kilz1
1PSS Polymer Standards Service GmbH, Mainz

Kontakt
Dr. Wolfgang Radke
Director Application Lab
PSS Polymer Standards Service GmbH
Mainz
WRadke@pss-polymer.com
www.pss-polymer.com

Dr. Wolfgang Radke
Nach einem Chemie-Studium an den Universitäten Mainz und Amherst spezialisierte sich Wolfgang Radke auf die Trennung von Polymeren mittels GPC/SEC und Polymer-HPLC. Seit 1999 war Dr. Radke zunächst stellvertretender Leiter und anschließend Leiter der Abteilung chemische Analytik am Deutschen Kunststoff-Institut (DKI). 2012 wurde er Gruppenleiter für Polymeranalytik am Fraunhofer Institut für Betriebssicherheit und Systemzuverlässigkeit LBF. Im Februar 2014 übernahm er  die Leitung für das PSS Applikationslabor in Mainz. Sein Schwerpunkt ist hier die Entwicklung von neuen Methoden und die Beratung bezüglich geeigneter Analysenverfahren für Makromoleküle. 

Peter Kilz
Nach einem Chemie-Studium an den Universitäten Mainz und Liverpool war Peter Kilz 1985 einer der Gründer von PSS Polymer Standards Service. Sein aktuelles Aufgabengebiet umfasst die Entwicklung von Lösungen im Bereich Polymer-LC-Systeme sowie die Integration von Chomatographiesystemen in das PSS Chromatographie-Datensystem (CDS) WinGPC. Sein methodischer Schwerpunkt liegt auf der Entwicklung von 2D-Lösungen für synthetische und natürliche Makromoleküle. 

Literatur
1. Peter Kilz, Wolfgang Radke: Application of two-dimensional chromatography to the characterization of macromolecules and biomacromolecules, Analytical and bioanalytical chemistry 407, (1), 193-215, (2015), DOI: 10.1007/s00216-014-8266-x.
2. Dwight R. Stoll, Xiaoping Li, Xiaoli Wang, Peter W. Carr, Sarah E.G. Porter, Sarah C. Rutan: Fast, comprehensive two-dimensional liquid chromatography, Journal of Chromatography A, 1168, 3-43 (2007), DOI: 10.1016/j.chroma.2007.08.054.
3. Peter Kilz, Harald Pasch: Coupled Liquid Chromatographic Techniques in Molecular Characterization. In Encyclopedia of Analytical Chemistry, 7495 ed.; R.A.Meyers, Ed. Wiley: Chichester; Vol. 9, 7495-7543 (2000), DOI: 10.1002/9780470027318.a2018.
4. Peter Kilz: Two-Dimensional Chromatography as an Essential Means for Understanding Macromolecular Structure, Chromatographia 59, 3-14 (2004), DOI: 10.1365/s10337-003-0106-7.
5. PSS 2D-Primer, PSS Polymer Standards Service GmbH, Mainz (2014).
6. Peter Schoenmakers, Philip Marriott, Jan Beens: Nomenclature and Conventions in Comprehensive Multidimensional Chromatography, LC-GC Europe 16, (6), 335 (2003).
7. Application Note WinGPC Software #61: Die Konfiguration des 2D Transferventils, PSS Polymer Standards Service GmbH, WinGPC Newsletter 01/2015 (2015)

Weitere Beiträge zum Thema: http://www.git-labor.de/category/tags/chromatographie
Chemgaroo Lerneinheit: http://www.chemgapedia.de/vsengine

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