Mikro-LC Grundlagen

Wenn es mal wieder schnell gehen muss

  • Mikro-LC-MS / MS-Kopplung  (© IUTA, Juri Leonhardt)Mikro-LC-MS / MS-Kopplung (© IUTA, Juri Leonhardt)
  • Mikro-LC-MS / MS-Kopplung  (© IUTA, Juri Leonhardt)
  • Abb. 1: Vergleich der Trennleistung für zwei Szenarien: a) - d) Trennung eines Gemisches auf einer 2,1 mm ID Säule und einem Agilent 1200-System mit a) Kapillar-ID: 125 µm, b) Kapillar-ID: 180 µm, c) Kapillar-ID: 260 µm und d) Kapillar-ID: 500 µm; e) - h) Trennung eines Gemisches auf einer 300 µm ID Säule und einem Eksigent ExpressLC ultra-System mit e) Kapillar-ID: 25 µm, f) Kapillar-ID: 50 µm, g) Kapillar-ID: 100 µm und h) Kapillar-ID: 250 µm.
  • Tab. 1: Vergleichende Darstellung der Varianz einer chromatographischen Bande in Relation zu den Außer-Säulen-Volumina. Alle Daten beziehen sich auf eine Säule mit einer Länge von 5 cm. Die grau schraffierten Felder beziehen sich auf typische Durchmesser für die Mikro-LC. *Annahme: Porosität 70% bei einer Säulenlänge von 50 mm; **Annahme: für eine Bodenzahl von 10.000 und einem Retentionsfaktor von 2; ***Annahme: Faktor 10 geringere Systemvarianz in Bezug auf die Trennsäulenvarianz
Nachhaltige Verfahren sind seit geraumer Zeit in aller Munde. In Bezug auf das analytische Labor gibt es viele Möglichkeiten, Energie einzusparen bzw. Ressourcen effizienter zu nutzen [1]. Neben den eigentlichen „Energiefressern“ wie z. B. Abzügen und Sicherheitswerkbänken müssen auch komplexe Analysengeräte einem kritischen Systemcheck unterzogen werden.
 
Während die Entwicklung im Bereich „intelligenter Telefone“ eindeutig in Richtung Miniaturisierung bei gleichzeitiger Leistungssteigerung fortgeschritten ist, sieht es für den Bereich der Analysentechnik eher konträr aus. Obwohl eine Leistungssteigerung stattgefunden hat, werden die Systeme immer komplexer und nehmen einen zunehmend größeren Raum ein. Laborplatz ist jedoch sehr kostbar und die Energiekosten für die Klimatisierung sind nicht zu vernachlässigen.
 
Miniaturisierung
 
Um den zur Verfügung stehenden Platz optimal ausnutzen zu können, bedarf es einer Miniaturisierung der Laborgeräte. Dies aber setzt voraus, dass die Implementierung miniaturisierter Analysensysteme konsequent umgesetzt wird. Warum sich dieser Prozess immer noch schleppend hinzieht und welche Potenziale dabei verschenkt werden, möchten wir im vorliegenden Beitrag für die miniaturisierte Flüssigkeitschromatographie verdeutlichen.
 
Dass miniaturisierte Analysensysteme eine Reihe von Vorteilen bieten, ist lange bekannt [2]. Die folgende Auflistung fasst die wesentlichen Vor- und Nachteile miniaturisierter HPLC-Systeme zusammen.
 
Vorteile
 
Geringer Verbrauch an Lösungsmitteln
Sehr gute Kompatibilität mit der Massenspektrometrie
Hohe lineare Fließgeschwindigkeiten
Geringer Probenbedarf
Geringer Platzbedarf
Geringer Energiebedarf
Geringer Einfluss von Reibungswärme
Geringes Gradientenverweilvolumen
 
Nachteile
 
Hoher Einfluss von Außer-Säulen-Volumina auf intrinsische, das hießt der Trennsäule „innewohnende“, Trenneffizienz
Geringere Sensitivität bei Kopplung mit spektroskopischen Detektoren
Noch limitierte Anzahl an verfügbaren stationären Phasen.
 
Routine
 
Warum also hat sich die Mikro-LC bis heute nicht in großem Umfang in Routinelaboratorien etabliert?

Die Antwort ist relativ simpel: je geringer der Innendurchmesser der Trennsäule und somit die Trennsäulenvarianz (σ2v,col) ist, desto größer ist der Einfluss des Volumens bzw. der Varianzen aller Bauteile wie Injektor (σ2v,inj), Kapillaren (σ2v,cap) und Detektor (σ2v,det) auf die resultierende Bandenverbreiterung und konsequenterweise auf die Trennleistung des chromatographischen Systems.

 
Peakverbreiterung
 
Prinzipiell kann eine chromatographische Bande als statistische Verteilung von Molekülen angesehen werden. Ein charakteristischer Parameter einer Verteilung ist das zweite Moment, auch als Varianz (σ2v) bezeichnet. Die Verbreiterung eines Peaks findet nicht nur in der Trennsäule statt, sondern beginnt bereits mit der Injektion und dem Transport der Probe durch die Kapillaren bis zur Säule. Dies gilt insbesondere bei isokratischer Arbeitsweise, wohingegen bei der Gradientenelution der Beitrag der Bauteile vor der Trennsäule, unter der Annahme ausreichender Retention, vernachlässigt werden kann. Anhand von Gleichung 1, die die Gesamtvarianz (σ2v,total) als Summe der Einzelbeiträge darstellt, kann dieser Sachverhalt nachvollzogen werden. (1)
 
 
Aus Gleichung 1 folgt daher die Zielvorgabe ein möglichst günstiges Verhältnis zwischen den Außer-Säulenvolumina, bestehend aus Injektor, Kapillaren sowie Detektor und dem Säulenvolumen zu erreichen, um möglichst wenig Trenneffizienz einzubüßen. Idealerweise sollte die Injektion als unendlich kleines Volumen direkt auf das chromatographische Bett erfolgen. Dies ist aus praktischer Sicht leider völlig unmöglich, obwohl es einzelne Ansätze gegeben hat, ein definiertes Volumen direkt auf die chromatographische Säule zu injizieren [3]. Darüber hinaus findet eine Verbreiterung des Peaks auch nach der Trennsäule statt. Neben den Kapillaren spielen insbesondere das Volumen und die Geometrie der Detektorzelle eine große Rolle. Die in Gleichung 1 wiedergegebenen Einzelbeiträge der Bandenverbreiterung können mehr oder weniger mathematisch angenähert werden, wobei diesen Annäherungen immer spezifische Annahmen zugrunde liegen [4]. Um demzufolge die intrinsische Trenneffizienz voll auszunutzen, müssen alle Beiträge, die zu einer signifikanten Bandenverbreiterung außerhalb der Trennsäule führen, drastisch reduziert werden. Je größer der Innendurchmesser der Säule, desto geringer sind die Beiträge dieser Außer-Säulen-Volumina auf die Trennleistung. Um diesen Sachverhalt besser zu illustrieren kann die Varianz der Trennsäule anhand von Gleichung 2 berechnet werden, wohingegen Tabelle 1 eine Auflistung der Varianzen in Abhängigkeit des Trennsäuleninnendurchmessers darstellt. (2)
 
 
Hierbei beziehen sich und L auf die Porosität, den Radius sowie die Länge der Säule, N ist die Bodenzahl und k der Retentionsfaktor.
 
Anhand der in Tabelle 1 zusammengestellten Daten wird ersichtlich, dass extreme Anforderungen an das Design und den Aufbau miniaturisierter HPLC-Systeme gestellt werden. Die grau schraffierten Felder beziehen sich dabei auf typische Durchmesser für Mikro-LC-Säulen. Während es bei Verwendung klassischer Säulenformate mit einem Innendurchmesser von 4,6 mm zu einem kaum merklichen Verlust der Trennleistung kommt, kann dies bei Mikro-LC-Systemen dramatische Auswirkungen haben, wenn die Systemvarianz nicht reduziert wird. Abbildung 1 zeigt den Vergleich einer Trennung, die auf einem konventionellen HPLC-System und einem Mikro-HPLC-System erzielt wird, wenn lediglich die Verbindungskapillare zwischen der Säule und dem Detektor ausgetauscht wird. Im ersten Fall wurde eine Säule mit einer Länge von 5 cm und einem Innendurchmesser von 2,1 mm verwendet. Der Unterschied in den Chromatogrammen ist auf den Austausch der Kapillaren nach der Trennsäule zurückzuführen, indem der Innendurchmesser zwischen 125 µm und 500 µm variiert wurde. Es ist erkennbar, dass bereits bei einem Wechsel von 125 µm auf 260 µm ein Verlust an Trenneffizienz zu beobachten ist. Erst beim Wechsel auf die Kapillare mit einem Durchmesser von 500 µm wird keine adäquate Trennung mehr erhalten. 
 
Ganz anders verhält es sich bei der Betrachtung der Chromatogramme in Abbildung 1 e) bis h). In diesem Fall wurde eine Säule mit einer Länge von 5 cm und einem Innendurchmesser von 300 µm verwendet. Es ist nur ein geringer Verlust an Trenneffizienz zu verzeichnen, wenn die Kapillare mit einem ID von 25 µm gegen eine Kapillare mit einem ID von 50 µm ausgetauscht wird. Vergrößert sich aber der ID auf 100 µm bzw. auf 250 µm, hat dies bereits dramatische Auswirkungen auf die Trenneffizienz, wie anhand der Peakbreite und Signalintensität nachvollzogen werden kann. Auch die Qualität der Kapillarverbindungen kann einen deutlichen Einfluss auf die Trennleistung ausüben.
 
Stand der Technik
 
Generell ist zu konstatieren, dass dedizierte HPLC-Systeme für Mikro- und Nano-LC-Anwendungen mit extrem geringen Außer-Säulen-Volumina kommerziell verfügbar sind. Darüber hinaus ist es mittlerweile möglich, kleinste Volumina von wenigen Nanolitern reproduzierbar zu injizieren. Des Weiteren bieten einige Hersteller auch entsprechende miniaturisierte HPLC-Säulen mit einem Innendurchmesser < 1 mm an. Die Technik ist also soweit fortgeschritten, dass keine Nachteile in Bezug auf die Leistungsfähigkeit oder Robustheit in Kauf genommen werden müssen [5]. Allerdings wirken sich „handwerkliche“ Fehler beim Betrieb eines solchen Systems deutlich gravierender auf die Qualität der Trennung aus, als dies bei klassischen (U)HPLC-Systemen der Fall ist. Dieser Aspekt, der im Wesentlichen die Schulung des Personals betrifft, ist nicht zu vernachlässigen und darf keinesfalls ignoriert werden. Die Tatsache, dass „intelligente Telefone“ mittlerweile auch von Personen aller Altersschichten bedient werden können, sollte ebenfalls ein Indiz dafür sein, dass auch die Einführung neuer und moderner Analysentechnologien nicht an das Alter des Laborpersonals gebunden ist. Eine erfolgreiche Implementierung miniaturisierter Analyseverfahren setzt allerdings auch hier die kritische Auseinandersetzung mit den Systemen voraus. Dies erfordert zumindest am Anfang Zeit, die bekanntlich rar gesät ist.

Autoren
Thorsten Teutenberg1, Terence Hetzel1, Denise Loeker1, Juri Leonhardt1

 
Zugehörigkeit
1Institut für Energie und Umwelttechnik e. V., IUTA, Duisburg
 
Kontakt
Dr. Thorsten Teutenberg
Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V. (IUTA)
Bereichsleiter Forschungsanalytik
Duisburg
teutenberg@iuta.de
 
Mehr zur Mikro-LC: http://www.git-labor.de/fortschrittliche-chromatographie
 
Nachhaltigkeit im Labor: http://www.niub-nachhaltigkeitsberatung.de/
 
 

Haben Sie Fragen zur Anwendung und Technik im Bereich Mikro-LC und 2D-LC? Fragen Sie die Experten vom IUTA: adlichrom@iuta.de

Referenzen:

1. NIUB - Nachhaltigkeitsberatung. http://www.niub-nachhaltigkeitsberatung.de

2. Ishii D, Asai K, Hibi K, Jonokuchi T, Nagaya M (1977) A study of micro-high-performance liquid chromatography: I. Development of technique for miniaturization of high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A 144 (2):157-168. doi:10.1016/S0021-9673(00)99351-8

3. Shalliker RA, Broyles BS, Guiochon G (2000) Physical evidence of two wall effects in liquid chromatography. J Chromatogr A 888 (1–2):1-12.

4. Buckenmaier S, Miller CA, van de Goor T, Dittmann MM (2015) Instrument contributions to resolution and sensitivity in ultra high performance liquid chromatography using small bore columns: Comparison of diode array and triple quadrupole mass spectrometry detection. J Chromatogr A 1377:64-74. doi:10.1016/j.chroma.2014.11.086

5. Hetzel T, vom Eyser C, Tuerk J, Teutenberg T, Schmidt TC (2016) Micro-liquid chromatography mass spectrometry for the analysis of antineoplastic drugs from wipe samples. Anal Bioanal Chem 408 (28):8221–8229.

 

Kontaktieren

Microsite Fortschrittliche Chromatographie


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