Moderne Raman-Spektroskopie aus Sicht der Industrie

Janus-Artikel: Die „moderne" Raman Spektroskopie: Aus Sicht der Industrie, sowie der Forschung und Entwicklung. In diesem Artikel lesen Sie die Raman-Spektroskopie aus der Sicht der Industrie. Die Sicht der Forschung Entwicklung von Michael Schmitt und Prof. Dr. Jürgen Popp, Friedrich-Schiller-Universität Jena, lesen Sie hier. Eine allgemeine Einleitung zum Thema finden Sie hier: http://www.git-labor.de/

Die Raman-Spektroskopie erlebt in den letzten Jahren eine regelrechte Renaissance. Der Grund dafür ist die Entwicklung des konfokalen Raman-Mikroskops, mit dem nicht nur die Aufnahme von Raman-Spektren sehr kleiner Probenvolumina möglicht ist, sondern auch die Aufnahme kompletter Bilder aus zehntausenden von Spektren in vormals undenkbar kurzer Zeit. 

Aus solchen Spektren lässt sich die chemische Zusammensetzung der untersuchten Proben mit einer lateralen Auflösung von unter 200 nm bestimmen. Während früher Belichtungszeiten von Minuten bis Stunden für einzelne Raman-Spektren üblich waren, konnten diese Zeiten bei der konfokalen Raman-Mikroskopie auf Sekundenbruchteile, teilweise sogar auf unter eine Millisekunde, reduziert werden. Möglich macht das bei einem auf maximale Transmission optimierten Mikroskop die Kombination von Filter-, Spektrometer- und Detektortechnologie. Die heute verwendeten Raman-Filter haben eine Transmission von über 95%, bei gleichzeitiger Unterdrückung der Laser-Anregungslinie um mehr als 6 Größenordnungen. Zusätzlich werden Spektroskopie-optimierte CCDs, die im sichtbaren Spektralbereich über 90% Quanteneffizienz aufweisen und nahezu Einzelphotonenempfindlich sind (rückseitengedünnte EMCCDs) verwendet.


Wellenlängen

Die Herausforderung für Hersteller von konfokalen Raman-Mikroskopen besteht nun darin mehrere, sich eigentlich widersprechende, Anforderungen unter einen Hut zu bringen.

Dies sind z.B.:

Flexibilität und einfache Bedienbarkeit, breiter nutzbarer Wellenlängenbereich (UV bis NIR) bei optimierter Empfindlichkeit, geringe Kosten bei gleichzeitig bester Performance und einfache Bedienbarkeit bei hohem Funktionsumfang.

Jeder Nutzer wünscht sich ein auf seine speziellen Wünsche und Anforderungen gebautes und optimiertes Gerät. Würde ein Hersteller tatsächlich seine Systeme speziell für einzelne Kunden bauen und optimieren, wäre ein solches System unbezahlbar. Die Lösung kann daher nur ein modulares System sein, bei dem die Basiskonfiguration in Soft- und Hardware identisch ist und das mit verschiedenen Modulen an die jeweiligen angepasst werden kann.

Ein typisches Problem bei der Konfiguration eines konfokalen Raman-Mikroskops ist ein breiter nutzbarer Spektralbereich. Ein Anwender möchte z.B. drei Anregungswellenlängen, die den Bereich von UV bis NIR abdecken, z.B. 355 nm, 532 nm und 785 nm. Die Raman-Linien liegen dann im Bereich 355-405 nm, 532-650 nm und 785-1100 nm. Das Gerät soll in jedem der drei Wellenlängenbereiche maximale Empfindlichkeit haben. Das ist mit einem einzelnen Spektrometer und einer einzigen Spektroskopiekamera eine praktisch unlösbare Aufgabe.

Zunächst benötigt man für jeden Wellenlängenbereich zwei bis drei optimierte Gitter. Ein Gitter das den entsprechenden RamanBereich von 0 bis ca. 4.000 cm-1 vollständig abdeckt und mindestens ein weiteres für hohe Auflösung. Für hohe Effizienz sind diese Gitter „geblazed", so dass das meiste Licht in die erste Beugungsordung fällt. Daher lassen sie sich ohne hohe Verluste nur in einem begrenzten Wellenlängenbereich einsetzen. Für die oben genannten 3 Wellenlängenbereiche braucht man daher mindestens 6 verschiedene Gitter.

Detektion


Von entscheidender Wichtigkeit ist der Detektor. In praktisch allen kommerziellen Raman-Mikroskopen werden CCD Kameras als Detektoren eingesetzt. Diese müssen aber ebenfalls für den Einsatzzweck optimiert werden. Bei Standard CCDs fällt das Licht von vorne auf die lichtempfindlichen Pixel (FI = front illuminated). Da diese durch Leitungen kontaktiert sind ist aber nur ein Teil des Detektors lichtempfindlich, so dass die Quanteneffizienz im günstigsten Fall 40% beträgt. Mikrolinsenarrays, die häufig in Consumerkameras zur Empfindlichkeitssteigerung verwendet werden, können aus Abtastgründen nicht eingesetzt werden. Daher bleibt nur die teure Variante der rückseitengedünnten (BI = back illuminated) CCDs. Diese erreichen einen Wirkungsgrad von über 95%, allerdings ebenfalls nur in einem begrenzten Spektralbereich. Im nahen IR muss man spezielle, dickere Varianten verwenden (DD = deep depletion), da ansonsten das berüchtigte Etaloning, ein als Funktion der Wellenlänge oszillierender Empfindlichkeitsverlauf, auftritt.

Bei Wellenlängen unterhalb von 400 nm lässt die Empfindlichkeit der CCDs ebenfalls stark nach, so dass hier auch wieder speziell angepasste Detektoren verwendet werden müssen.

Anwender die sich im Hitech-Bereich oder in der Forschung bewegen, erwarten zu Recht höchste Performance von einem Raman-System. Eine Lösung für ein wirklich optimiertes konfokales Raman-Mikroskop mit drei Lasern (355 nm, 532 nm und 785 nm) besitzt daher drei Spektrometer, jedes bestückt mit optimierten Gittern und der entsprechenden CCD. Ein einfaches Raman-Mikroskop mit den gleichen drei Lasern, aber nur einem Spektrometer und einer Breitband-CCD hat dagegen bei optimaler Auslegung im grünen Spektralbereich ca. 40%, im UV und im NIR dagegen weniger als 10% der Empfindlichkeit des optimierten Systems. Steht beim Design der UV oder NIR Bereich im Vordergrund, so liegen die Werte noch deutlich darunter.

Ein System mit nur einem Spektrometer und einer CCD mag deutlich kostengünstiger sein als ein optimiertes System mit 3 Spektrometern und 3 CCDs. Allerdings ist der Performancegewinn bei einem bildgebenden Raman-Mikroskop extrem wichtig. So sinkt nicht nur das Signal linear mit der Empfindlichkeit, zusätzlich steigt auch das Dunkelrauschen mit der Meßzeit an (thermisches Rauschen, Cosmic Rays), so dass eine lineare Erhöhung der Meßzeit zur Kompensation der geringeren Empfindlichkeit nicht ausreicht.

Anwendungen

Ein weiterer Punkt ist, dass sich viele Einflußfaktoren bei langen Meßzeiten sehr stark störend bemerkbar machen (thermische Drift, Fokusdrift, thermische Stabilität von Spektrometer und Laser etc.). Diese spielen bis ca. 30 min Meßzeit fast keine Rolle, bei 10fach geringer Empfindlichkeit und entsprechend verlängerter Meßzeit auf deutlich über 5 h haben diese Faktoren jedoch erheblichen Einfluß, ganz abgesehen von der strapazierten Geduld des Nutzers.
Der Wunsch nach UV-Anregungswellenlängen ist von Forschungsgruppen im akademischen Umfeld häufig zu hören, insbesondere wird hier häufig das Argument der höheren Raman-Effizienz sowie der Fluoreszenzfreiheit genannt. Diese Argumente mögen zunächst verfangen, in der Praxis sprechen aber vielfältige Gründe dagegen. Raman-Spektroskopie ist nur solange eine zerstörungsfreie Methode, wie die intensive Laserstrahlung nicht in nennenswertem Umfang von den Proben absorbiert und diese dadurch aufgeheizt und damit zerstört werden. Dies ist insbesondere bei der Raman-Mikroskopie kritisch, bei der ein sehr stark fokussierter Laserstrahl eingesetzt wird. Bei UV-Laserstrahlung von z.B. 244 nm hat man es darüber hinaus mit sehr energiereichen Photonen von mehr als 5 eV zu tun, die fast jede organische Probe in kurzer Zeit zerstören können. Ein großes Problem ist weiterhin, dass es für 244 nm Anregungswellenlänge kaum gute (und bezahlbare) Optiken gibt. Praktisch alle gängigen, UV-optimierten Mikroskopobjektive funktionieren nur bis herunter zu ca. 340 - 350 nm zufriedenstellend, Standardobjektive sogar nur bis ca. 400 nm. Die geringe Empfindlichkeiten der Detektoren und der Beugungsgitter, die geringe Sammeleffizienz und Auflösung der Objektive sowie die geringe verwendbare Laserleistung sorgen dafür, dass sich der vermeintliche Effizienzvorteil in der Praxis praktisch immer in das Gegenteil verkehrt, so dass man mit einem gut optimierten konfokalen Raman-Mikroskop und 532 cnm Anregungswellenlänge fast immer bessere Ergebnisse erzielt, von der lateralen Auflösung ganz zu schweigen.

Eine weitere Herausforderung ist das sehr unterschiedliche Nutzerprofil. In Universitätslabors arbeiten sehr gut ausgebildete Spezialisten, die möglichst viele Informationen aus einer Probe herauskitzeln wollen. Hier steht nicht die leichte Bedienbarkeit im Vordergrund, sondern die Flexibilität und Leistungsfähigkeit des Systems. Wichtig ist, auch ausgefeilteste Softwarealgorithmen verwenden zu können um möglichst viel Information aus den vorhandenen Daten herauszuholen. Die Performance des Systems steht im Vordergrund. In den Universitäten gibt es aber auch Servicelabors, zu denen viele Forscher Zugang haben um ihre Proben dort mit verschiedensten Untersuchungsmethoden zu vermessen. Die Forscher arbeiten nicht täglich mit allen Geräten, daher sollte ein solches System robust und einfach zu bedienen sein. Am anderen Ende stehen Forschungslabors der Industrie, in denen die Mitarbeiter ein wichtiger Kostenfaktor sind. Die Anschaffungskosten des Geräts sind viel weniger wichtig als die Tatsache, dass auch ein Techniker damit zurechtkommt und routinemäßig immer die gleichen Resultate erzielen kann.

Aus Herstellersicht kann diesem Umstand dadurch Rechnung getragen werden, dass mittels einer bedienerfreundlichen Software die Aufnahme von Messdaten und deren Auswertung soweit wie möglich vereinfacht oder sogar automatisiert wird. Modular aufgebaute Raman-Mikroskope lassen sich leicht für unterschiedlichste Ansprüche in Forschung und Industrie konfigurieren. Das hat den weiteren Vorteil, dass ein einmal erworbenes Gerät auch nach Jahren noch an wechselnde Aufgabengebiete angepasst werden kann.

Autoren
Harald Fischer
, Witec, Ulm
Dr. Olaf Hollrichter, Witec, Ulm

Kontaktieren

WITec GmbH
Lise-Meitner-Str. 6
89081 Ulm
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Telefon: +49 731 140 700
Telefax: +49 731 140 70 200

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