Nahinfrarotspektroskopie als schnelle, zuverlässige und kostengünstige Methode

Qualitätsbestimmung pflanzlicher Rohstoffe

  • Abb. 1: Prinzipieller Aufbau eines Fourier-Transform (FT) NIR-Spektrometers. Abb. 1: Prinzipieller Aufbau eines Fourier-Transform (FT) NIR-Spektrometers.
  • Abb. 1: Prinzipieller Aufbau eines Fourier-Transform (FT) NIR-Spektrometers.
  • Abb. 2: NIRS-Spektren (Absorption in Abhängigkeit von der Wellenzahl) einer Rapsölprobe, aufgenommen mit drei unterschiedlichen NIR-Spektrometern: Multi Purpose Analyzer (MPA, FT-NIR-Spektrometer), Bruker; InfraAlyzer (dispersives Spektrometer), Bran+Lübbe; Rapid Content Analyzer (XDS, FT-NIR-Spektrometer), Foss
  • Abb. 3: Standardabweichungen der Absorptionshöhen je 10fach wiederholter FT-NIR-Spektren vermahlener (Planetenkugelmühle, Stahlkugeln) Fasernesselstängel in Abhängigkeit von der Probenmenge in der Küvette (3 g, 5 g, 7 g); MPA, Bruker
  • Tab. 1: Ausgewählte Beispiele für eigene NIR-Kalibrationen zur Qualitätsuntersuchung pflanzlicher Rohstoffe

Die Nahinfrarot (NIR) -Spektroskopie hat erstmals vor ca. 4 Jahrzehnten in den USA in der Landwirtschaft verbreitet Anwendung zur Bestimmung von Protein-, Kohlenhydrat- und Fettgehalt in Getreide und Ölsaaten, später auch zur Bestimmung des Rohfasergehaltes in Pflanzen gefunden. Erst danach wurde die NIR-Spektroskopie auch in Europa bekannt und fand dort zunächst in den gleichen Bereichen Anwendung.

Die Möglichkeiten der Applikation wachsen aufgrund der vielen Vorteile seitdem ständig, so machen sich z. B. auch die chemische Industrie oder die Pharmaindustrie die NIR-Spektroskopie beispielsweise zur qualitativen Analyse und quantitativen Bestimmung verschiedener Qualitätsparameter von Tabletten und anderer Pharmazeutika zu Nutze. Auch im Zusammenhang mit der verstärkten Nutzung pflanzlicher Rohstoffe im stofflichen und energetischen Bereich ergeben sich neue und vielfältige Anwendungsmöglichkeit der NIR-Spektroskopie in der Qualitätssicherung.

Schwingungen der Moleküle
Als Spektroskopie bezeichnet man allgemein die Wechselwirkung zwischen Licht und Materie. Bei der IR-Spektroskopie werden die Schwingungsfreiheitsgrade der bestrahlten Moleküle angeregt. Es kommt zu Absorptionsbanden im IR-Spektrum, deren Grundtöne im MIR-Bereich (Wellenzahl: 200 - 4.000 cm-1 bzw. Wellenlänge: 25.000 - 2.500 nm) und die Kombinations- bzw. Obertöne im NIR-Bereich (4.000 - 12.500 cm-1 bzw. 2.500 - 800 nm) zu finden sind.

Angeregt werden im NIR-Bereich lediglich die C-H-, N-H-, C-O- und O-H-Bindungen. Jede Bindung wird bei unterschiedlichen Wellenlängen in Schwingung versetzt, diese Schwingung benötigt Energie, welche aus dem Licht bezogen wird. So zeichnet das NIR-Spektrometer je nach Typ die Transmission, die Reflexion oder die Transflektion mittels Detektor auf, welche dann in Abhängigkeit zur Wellenlänge als NIR-Spektrum der entsprechenden Probe festgehalten wird [1].

Unter der Voraussetzung, dass für die/den zu untersuchenden Parameter eine gut funktionierende Kalibration erstellt werden kann (u. a. abhängig von Substanzart und -zusammensetzung, Massenanteil des gesuchten Analyten, Art der Matrix, in die der Analyt evtl.

eingebettet ist), weist die NIRS-Methode gegenüber vielen nasschemischen Analyseverfahren u. a. die folgenden Vorteile auf:

  • hoher Probendurchsatz: Die Messung benötigt inklusive Speicherung und Wiederholung (= Doppelbestimmung) nur sehr wenig Zeit,
  • relativ einfache Bedienung: Nach kurzer Einführung in die Software sind zur bloßen Durchführung von Messungen kaum weitere Kenntnisse notwendig,
  • Bei bestimmten Spektrometern ist ein mobiler Einsatz möglich, d. h. Messung direkt vor Ort, z. B. während der Ernte, im Lager, oder auch Online-Messungen bei laufender Produktion,
  • durch Parallelschaltung mehrerer Kalibrationen ist die Bestimmung mehrerer Merkmale simultan möglich,
  • Kalibrationstransfer von Gerät zu Gerät möglich (‚Inter‘- und ,Intra-Brand‘-Transfer),
  • einmalige Anschaffung kostspielig, auf Dauer jedoch geldsparend, da Kosten für herkömmliche Bestimmungsmethoden (z. B. HPLC u. a.) entfallen.

Gerätetypen
Ein NIR-Spektrometer besteht im Allgemeinen aus den folgenden funktionellen Bauelementen [2] (Abb. 1)

  • Infrarot-Strahlungsquelle,
  • Spektralapparat zur Selektion und Bestimmung der Wellenzahl,
  • optisches System für möglichst verlustfreie Übertragung der Strahlung von der Strahlungsquelle bis zum Detektor,
  • Detektor zum Umwandeln des optischen Signals in ein elektrisches Signal,
  • Messwertausgabeeinheit mit Messwertwandler (Computer, Schreiber, etc.).

Inzwischen ist eine Vielzahl verschiedener NIRS-Spektrometer von unterschiedlichen Herstellern auf dem Markt, die sich u. a. in der Art der Lichterzeugung bestimmter Wellenlängen und dem Spektralbereich unterscheiden. Bei einigen Geräten erfolgt die Wellenlängenselektion durch bewegliche, bei anderen durch feste Bauteile (Abb. 1).

Die Entwicklung einer NIRS-Kalibration erfolgt, unabhängig vom Gerätetyp, unter Verwendung verschiedener Regressionsverfahren (MLR, PLS, MPLS u. a.) durch Erstellung eines chemometrischen Modells. Dieses erklärt den statistischen Zusammenhang zwischen den NIR-Spektren (Abb. 2), ggf. nach entsprechender Datenvorbehandlung, und den mit klassischen Labormethoden ermittelten Werten des jeweiligen Analyten (= Referenzwerten) einer möglichst hohen Anzahl an für die zu untersuchende Probenmatrix repräsentativen Referenzproben. Die Güte des Vorhersagemodells wird mit üblichen statistischen Maßzahlen (Bestimmtheitsmaß, Vorhersagefehler u. a.) beurteilt. In einem weiteren Schritt erfolgt dann die Validierung des Modells mit weiteren, externen Proben, die nicht bereits in der Kalibration enthalten sind. Mit Hilfe eines auf diese Art und Weise errechneten und validierten Algorithmus lassen sich dann auch die Inhaltsstoffe in gleichem Probenmaterial schätzen, ohne dass diese Proben mit den z. T. aufwändigen Referenzmethoden (GC, HPLC u. a.) untersucht werden müssen.

Einsatzgebiete
Es würde den Rahmen dieses Beitrages bei Weitem übersteigen, alle bislang im Einsatz befindlichen NIRS-Methoden zur Qualitätsbestimmung pflanzlicher Rohstoffe mit ihren Einsatzgebieten aufzuführen. Im Folgenden wird daher eine Auswahl an unserer Arbeitsgruppe in den letzten Jahren bearbeiteten Methoden kurz vorgestellt (Tab. 1).

Wie aus der Tabelle 1 hervorgeht, ist bei festem Probenmaterial in der Regel eine gründliche und homogene Zerkleinerung des Probenmaterials unabdingbar, insbesondere, wenn das Ausgangsmaterial an sich inhomogen ist (z. B. Stängel der Fasernessel) oder die Inhaltsstoffkonzentrationen sehr niedrig sind (z. B. Artemisinin in Einjährigem Beifuß). In manchen Fällen, z. B. im Bereich der Pflanzenzüchtung, wo es von großem Vorteil sein kann, wertvolles Zuchtmaterial zerstörungsfrei zu untersuchen, um es nach der Selektion aussäen zu können, oder wenn es auf besondere Schnelligkeit ankommt (Landhandel, Rohstoffeingangskontrolle u. a.), kann die Methodenentwicklung auch an unzerkleinertem Probenmaterial erfolgen (z. B. Sonnenblumen, Raps, Getreide u. a.); unter Umständen geht dies, in Abhängigkeit von der Morphologie der Saaten und dem zu untersuchenden Inhaltsstoff, mit einer gewissen Einschränkung der Vorhersagegenauigkeit einher, was aber in der Regel im Praxiseinsatz aufgrund der genannten Vorteile toleriert werden kann.

Bevor mit der eigentlichen Kalibrationsentwicklung begonnen wird, sollte in jedem Fall zunächst in Vorversuchen eine optimale Vorgehensweise zur Probenpräsentation ermittelt werden; dies umfasst z. B. die Wahl eines geeigneten Zerkleinerungsverfahrens, evtl. Trocknung, geeignete Küvetten, Einwaage und Verdichtung des Probenmaterials, Überprüfen von Temperatureinfluss und Lagerdauer der Proben, Datenvorbehandlung wie z. B. Ableitungen und Streulichtkorrekturen, Ermittlung geeigneter Geräteeinstellungen (Wellenzahlbereich, Anzahl Scans u. a.). Diese Vorarbeiten dienen dazu, möglichst reproduzierbare Spektren des jeweiligen Probenmaterials zu erzeugen (Abb. 3). In vielen Fällen, insbesondere bei instabilen Analyten wie z. B. vielen sekundären Pflanzeninhaltsstoffen, ist es zudem ausgesprochen wichtig, dass Referenzanalytik und Spektrenaufnahme zeitlich sehr nahe beieinander liegen, um eine Veränderung der Proben hinsichtlich ihrer Inhaltsstoffe auszuschließen.

Bei der Beurteilung einer NIR-Kalibration kommt der Beurteilung der Präzision der Referenzmethode, die den Kalibrationswerten zugrunde liegt, eine entscheidende Bedeutung zu, denn die NIR-Methode kann niemals präziser sein als die referenzanalytische Methode. Die Auswahl der Kalibrations- und Validationsproben sowie die Durchführung der Referenzanalytik sollten daher mit größter Sorgfalt erfolgen. Wenn möglich, sollten daher Wiederholbarkeits- (r) und Vergleichbarkeitsgrenzen (R) in Relation zum Fehler der NIR-Schätzung herangezogen werden.

Kalibrationstransfer
Der Transfer von NIRS-Methoden bietet den Vorteil, eine erstellte Kalibrationsgleichung auf weiteren Spektrometern nutzbar zu machen. Hiermit entfallen für die Anwenderinnen und Anwender arbeits- und kostenintensive Probenanalysen sowie der Aufwand für die Erstellung einer multivariaten Kalibration. Weiterhin kann als großer Vorteil des Kalibrationstransfers angesehen werden, dass somit auf den unterschiedlichen Spektrometern einheitliche, vergleichbare Ergebnisse erzielt werden können. Für den Transfer stehen Algorithmen wie z. B. piecewise direct standardisation (PDS) [3] oder das Standardisierungsverfahren nach Shenk und Westerhaus [4] zur Verfügung.

Fazit
Der Einsatz von NIR-basierten Untersuchungsverfahren bietet nach erfolgreicher Kalibrationsentwicklung und ggf. nach einem Kalibrationstransfer in vielen Bereichen der Produktion und Verarbeitung pflanzlicher Rohstoffe ein großes Potential im Rahmen der Qualitätskontrolle und -sicherung zur Einsparung von Kosten, Material und Zeit.

Literatur
[1] Siesler H. W. et al. (Hrsg.): Near-Infrared Spectroscopy, Wiley-VCH Verlag, Weinheim, (2002)
[2] Gottwald W. und Wachter G. (Hrsg.): IR-Spektroskopie für Anwender, Wiley-VCH Verlag, Weinheim, (1997)
[3] Wang Y. et al.: Analytical Chemistry, 64, 562-564 (1992)
[4] Shenk J. S. und Westerhaus M. O.: Crop Science 31, 1694-1696 (1991)

 

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