Nanoporöse Membranen für Medizin und Biotechnologie

Nanoporöse Aluminiumoxidmembranen für Medizin und Biotechnologie

  • TAbb. 1: REM-Abbildungen von nanoporösen Aluminiumoxidmembranen. Links: Porenstruktur, Mitte: Querschnitt [5], Rechts: Oberflächenmodifizierte Porenkanäle [3]TAbb. 1: REM-Abbildungen von nanoporösen Aluminiumoxidmembranen. Links: Porenstruktur, Mitte: Querschnitt [5], Rechts: Oberflächenmodifizierte Porenkanäle [3]
  • TAbb. 1: REM-Abbildungen von nanoporösen Aluminiumoxidmembranen. Links: Porenstruktur, Mitte: Querschnitt [5], Rechts: Oberflächenmodifizierte Porenkanäle [3]
  • Abb. 2: Virenrückhalt (Tabakmosaikvirus-TMV) in Abhängigkeit unterschiedlicher Porendurchmesser, Einschub: TEM-Abbildung von Tabakmosaikviren(TMV)
  • Abb. 3: Harnstoffsynthese von primären Hepatozyten als Marker für die Zellfunktionalität in Abhängigkeit unterschiedlicher Kulturbedingungen [8]
  • Abb. 4: Links: Nachweis der DNA, rechts: schematische Darstellung des Biochip-Arrays
  • Dipl.-Ing. (FH) Annika Thormann, Wiss. Mitarbeiterin Polymerfolien und Membranen, ­Fraunhofer-­Institut fü­r Werkstoffmechanik IWM
  • Prof. Dr. Andreas Heilmann, Leiter Biologische Materialien und Grenzflächen, Fraunhofer-Institut für Werkstoffmechanik IWM

Nanoporöse Aluminiumoxidmembranen, hergestellt mittels anodischer Oxidation, zeichnen sich durch beidseitig offene, parallele Poren mit regelmäßiger Porenstruktur, hohe Zugänglichkeit und enge Porengrößenverteilung aus. Weiterhin sind diese Membranen durch eine hohe optische Transparenz sowie geringe Eigenfluoreszenz gekennzeichnet. Potentielle Einsatzfelder der nanoporösen Aluminiumoxidmembranen liegen in der Bio- und Lebensmittelindustrie (Keimfreiheit von Produkten) und in der Medizintechnik (Sterilfiltration). Weiterhin können die nanoporösen Membranen im Tissue Engineering zur Zellkultivierung eingesetzt werden. Aktueller Forschungsschwerpunkt ist die Anwendung der nanoporösen Membranen als dreidimensionales Biochip-Array.

Herstellung/Membranpräparation
Durch anodische Oxidation von reinem Aluminium (4N) in sauren Elektrolyten wird auf der Oberfläche des Aluminiums eine nanoporöse Oxidschicht mit senkrecht zur Oberfläche angeordneten, parallelen Nanoporen erzeugt. Die Porengröße kann durch die Herstellungsparameter Anodisierungsspannung, Temperatur und Elektrolytkonzentration zwischen 20 und 450 nm eingestellt werden. Die Schichtdicke (30-200 µm) wird durch die Anodisierungszeit bestimmt. Für die Herstellung von freitragenden Aluminiumoxidmembranen werden die durch anodische Oxidation hergestellten porösen Schichten vom Grundmetall durch ein spezielles Verfahren abgelöst. Durch einen weiteren Ätzschritt werden die noch verschlossenen Poren der erhaltenen Membran geöffnet. Man erhält somit eine hohe offene Porosität von 40-50 % [1 - 3].
Die Membranen können derzeit in Flächen von bis zu 100 cm² als freitragende Membran hergestellt und durch Laserschneiden in eine beliebige äußere Form gebracht werden. Durch ein vom Fraunhofer IWM patentiertes Verfahren kann das Aspektverhältnis von Porendurchmesser/Porenlänge bei gleichzeitiger Erhöhung der mechanischen Stabilität optimiert werden. Dabei wird das Basismaterial „Aluminium" mittels thermomechanischer Prägung oder durch laserbasierende Strukturierung vorstrukturiert. Nach der anodischen Oxidation erhält man sehr dünne Bereiche (bis zu 1,5 µm), die durch die Aluminiumstege stabilisiert werden (Abb.

1). Falls erforderlich können die Poreninnenwände für verschiedene Anwendungen zusätzlich noch oberflächenfunktionalisiert werden (Abb. 1 rechts) [3-5]. Anders als bei dem konventionellen Produkt Anopore stehen somit Membranen zur Verfügung, die bezüglich Porendurchmesser, Membrangröße und Oberflächeneigenschaften an Kundenwünsche und Einsatzfälle angepasst werden können.

Sterilfiltration
Für die Sterilfiltration in der Biotechnologie und Medizintechnik werden zuverlässige Membranen benötigt. Herstellungsbedingt kann bei den keramischen Filtrationsmaterialien aus anodisch oxidiertem Aluminium ausgeschlossen werden, dass deutlich größere Poren zufällig auftreten. Dies kann bei Membranfiltern aus Polymeren nicht garantiert werden. Filtrationsmembranen aus nanoporösen Aluminiumoxid können daher hervorragende Partikelretention sowie einen vollständigen Schutz z. B. vor infektiösen Keimen, Bakteriophagen oder Viren gewährleisten. Die spezifische Durchflussrate wird durch die Porengröße, Porosität und Membrandicke bestimmt und kann für den Einsatz beim Anwender über zwei Größenbereiche gezielt eingestellt werden. Bisher wurden für die Sterilfiltration anwendungsorientierte Filtermodule mit einstellbaren Porengrößen im Bereich 12 - 200 nm entwickelt. Die biologische Sicherheit wurde unter Verwendung von nichtpathogenen Pflanzenviren (Tabakmosaikviren) getestet. In Abbildung 2 ist der Virenrückhalt unterschiedlicher Membranen dargestellt. Ab einer Porengröße kleiner 18 nm konnte für die Tabakmosaikviren ein vollständiger Rückhalt gewährleistet werden.

Zellkultivierung
Hepatozyten sind bipolare epitheliale Zellen der Leber mit selektivem Stoffaustausch auf basolateraler und apikaler Zellseite. Um dem Mikromilieu in vivo zu entsprechen, ist für die Kultivierung der primären Zellen ein Trägermaterial zu favorisieren, dass ihnen einen basolateralen Stoffaustausch ermöglicht. Eine Kokultur mit Nicht-Parenchymzellen sollte die Kultur primärer Hepatozyten optimieren. Daher wurden nanoporöse Aluminiumoxidmembranen für eine Zellkokultur verwendet [6 - 9]. Primäre Hepatozyten und Nicht-Parenchymzellen wurden jeweils auf einer Seite der Membran kultiviert und in einem Zweikammer-Durchflussreaktor eingesetzt. Die hepatozytäre Synthese von Harnstoff diente als Marker zur Ermittlung des funktionellen Differenzierungsgrades im Kulturverlauf.
Die Kultur primärer Hepatozyten auf Aluminiumoxidmembranen war bei verschiedenen Porengrößen (25 - 240 nm) erfolgreich. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten eine feste Verankerung der Zellen mit dem Trägermaterial. Die durch Hepatozyten in Kokultur mit Nicht-Parenchymzellen bewachsenen Membranen wurden als Trennwand in eine Durchflusskammer eingebracht, die kontinuierlich mit Medium perfundiert wurde. Im Gegensatz zur konventionellen Monolayerkultur blieb dabei die Harnstoffsyntheserate während einer Kulturzeit von 7 Tagen auf gleich hohem Niveau (s. Abb. 3). Primäre Hepatozyten konnten so in Kokultur mit Nicht-Parenchymzellen der Leber auf nanoporösen Aluminiumoxidmembranen bei anhaltend hoher Harnstoffsyntheseleistung kultiviert werden. Der Einsatz der mit Zellen bewachsenen Membranen in einem Durchflussreaktor bietet für primäre Hepatozyten optimale Kulturbedingungen bei gleichzeitigem Erhalt spezifischer hepatozytärer Eigenschaften. Differenzierte Hepatozyten können in diesem Reaktor für Transplantationszwecke vermehrt werden.

Biochip-Array
Die Mikroarray-Biochip-Technologie ist ein wichtiges Werkzeug für die Diagnostik in Medizin, Pharmazie, Biochemie, Genetik und Mikrobiologie. Klassische Biochips (Mikroarrays) bestehen aus einer Vielzahl von systematisch angeordneten kleinen Spots auf einem planaren 2D-Träger aus Glas, Kunststoff oder Metall. Durch den Übergang von der planaren 2D-Matrix zu einer porösen 3D-Matrix auf Basis von nanoporösen Aluminiumoxid erfolgt eine deutliche Vergrößerung der nutzbaren Oberfläche. Die signifikante Erhöhung der Sondenanzahl und -dichte führt zu einer erhebliche Erhöhung der Messempfindlichkeit und -geschwindigkeit bei einer gleichzeitigen Miniaturisierung der Chipgröße und der Verringerung des Probenvolumens. Die Entwicklung erfolgt in Zusammenarbeit mit der Firma Smart Membranes, Halle.
Die entwickelten Biochip-Arrays haben eine Gesamtgröße von 26 x 76 mm2 mit Spotdurchmessern von 300 µm (thermomechanische Prägung) oder 30 µm (laserstrukturiert). In den Spots befindet sich die 3D-Porenmatrix mit einer Schichtdicke von 50 µm sowie einem Porendurchmesser von 225 nm bei einer Porosität von 42 %.
Um eine feste Kopplung von Oligonukleotiden bzw. Nukleinsäuren (DNA) an die Oberfläche des entwickelten Biochip-Arrays zu gewährleisten, müssen die Poreninnenwände vorher aktiviert werden. Zur Aktivierung wurde der Organosilan-Linker 3-Aminopropyltrimethoxysilan eingesetzt. Dadurch erhält die Oberfläche des Biochip-Arrays eine positive Ladung mit reaktiven primären Aminen (-NH3+ ). Durch die elektrostatische Wechselwirkung der positiv-geladenen Aminosilan-Gruppen des Biochip-Arrays mit den negativ geladenen Gruppen des DNA-Phospahtrückgrats kann nun eine feste elektrostatische Bindung zwischen den Aminen (-NH3+ ) und der DNA erfolgen. Der Nachweis der Silanisierung mit 3Aminopropyltrimethoxysilan erfolgte mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDX-Nanospotanalyse). Durch die Detektion von Silizium und Stickstoff anhand der erhaltenen EDX-Spektren konnte für die hergestellten Biochip-Arrays eine Aktivierung der Poreninnenwand nach Silanisierung nachgewiesen werden. An die erfolgreiche Aktivierung schließt sich die Biofunktionalisierung mit den DNA-Sonden an. Als Sonden wurden hybridisierungsfähige und mit Cyanin-Farbstoffen (Cy3 und Cy5) fluoreszenzmarkierte DNA-Sequenzen mit unterschiedlichen Basenpaaren genutzt. Die Immobilisierung der DNA-Sonden erfolgte durch Spotting mit anschließendem UV-Crosslinking. Nach verschiedenen Waschschritten wird mittels Plate-Reader die Fluoreszenzintensität der gebunden DNA-Sonden gemessen. Es zeigte sich, dass die Kopplung der DNA-Sonden vorrangig über die Aminogruppen der Silanschicht erfolgt und eine unspezifische Bindung am reinen Substrat vernachlässigbar ist. Die Immobilisierungseffizienz und Stabilität der DNA-Sonden der neuartigen 3D-Biochip-Arrays ist im Vergleich zu herkömmlichen Aminogruppen an funktionalisierten HTA-Slides in Abbildung 4 dargestellt Die über die Fluoreszenzintensität ermittelte Konzentration der DNS-Sondenmoleküle ist 5,3 bis 19,4 mal höher als bei herkömmlichen 2D-Biochip-Arrays.

Literatur
[1] Hanaoka T.-A. et al.: Appl. Organometall. Chem. 12, 367-373 (1998)
[2] Heilmann A. et al.: Applied Surface Science 144-145, 682-685 (1999)
[3] Heilmann A. et al.: Journal of Nanoscience and Nanotechnology 3, 375-379 (2003)
[4] Müller S. et al.: J. Biomedical Nanotechnology 2, 16-22 (2006)
[5] Thormann A. et al.: Small 3, 1032-1040 (2007)
[6] Hoess A. et al.: Journal of Biomedical Materials Research A (2012) doi. 10.1002/jbm.a.34158
[7] Hoess A. et al.: Acta biomaterialica 3, 43-50 (2007)
[8] Hoess A. et al.: Advanced Engineering Materials 12, B269-B275 (2010)
[9] Ferraz N. et al.: Journal of Nanoscience and Nanotechnology 11, 6698-6704 (2011)

 

Autor(en)

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Walter-Hülse-Str. 1
06120 Halle
Germany

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