Probenvorbereitung in der Massenspektrometrie

Die wichtige Rolle der Probenvorbereitung in der quantitativen Spurenanalyse

  • Abb. 1: Schematische Darstellung einer Elektronenstoßionisationsquelle (A) zur Erzeugung von Ionen aus dem GC-Eluent und Beschleunigung in das Massenspektrometer unter Hochvakuum. Der aus einer großen Anzahl von Fragment-Ionen bestehende Ionenstrom wird durch Anlegen einer Elektronenenergie von 70 eV erzeugt (B). Bei einem beliebigen Molekül werden bei Erhöhung der Elektronenergie und Überschreitung des Ionisierungspotentials des Analyten (a) im Schwellenbereich (b) zunehmend intakte molekulare Ionen und anschließend signifikante Mengen von Fragment-Ionen (c) erzeugt. Schließlich wird ein Plateau erreicht, bei dem für eine große Bandbreite von Molekülarten eine große Anzahl von Fragment-Ionen erzeugt wird (d).Abb. 1: Schematische Darstellung einer Elektronenstoßionisationsquelle (A) zur Erzeugung von Ionen aus dem GC-Eluent und Beschleunigung in das Massenspektrometer unter Hochvakuum. Der aus einer großen Anzahl von Fragment-Ionen bestehende Ionenstrom wird durch Anlegen einer Elektronenenergie von 70 eV erzeugt (B). Bei einem beliebigen Molekül werden bei Erhöhung der Elektronenergie und Überschreitung des Ionisierungspotentials des Analyten (a) im Schwellenbereich (b) zunehmend intakte molekulare Ionen und anschließend signifikante Mengen von Fragment-Ionen (c) erzeugt. Schließlich wird ein Plateau erreicht, bei dem für eine große Bandbreite von Molekülarten eine große Anzahl von Fragment-Ionen erzeugt wird (d).
  • Abb. 1: Schematische Darstellung einer Elektronenstoßionisationsquelle (A) zur Erzeugung von Ionen aus dem GC-Eluent und Beschleunigung in das Massenspektrometer unter Hochvakuum. Der aus einer großen Anzahl von Fragment-Ionen bestehende Ionenstrom wird durch Anlegen einer Elektronenenergie von 70 eV erzeugt (B). Bei einem beliebigen Molekül werden bei Erhöhung der Elektronenergie und Überschreitung des Ionisierungspotentials des Analyten (a) im Schwellenbereich (b) zunehmend intakte molekulare Ionen und anschließend signifikante Mengen von Fragment-Ionen (c) erzeugt. Schließlich wird ein Plateau erreicht, bei dem für eine große Bandbreite von Molekülarten eine große Anzahl von Fragment-Ionen erzeugt wird (d).
  • Abb. 2: Die Elektrospray-Ionisation findet in einer Sprühkammer unter Atmosphärendruck statt (A). Eine unter Hochspannung stehende Kapillare erzeugt einen Nebel aus geladenen Tröpfchen, die bei der Desolvation Ionen in die Gasphase entlassen. Die Ionen werden vom Massenspektrometer erfasst, dessen Eingang häufig im rechten Winkel zur Sprühachse angeordnet ist, um das Eintragen von neutralen Teilchen in den Hochvakuumbereich zu begrenzen. Im Tröpfchen (B) konkurrieren Analyten um eine begrenzte Anzahl von geladenen Stellen an der Oberfläche der Tröpfchen. Auf der Grundlage des Verteilungsgleichgewichtsmodells [4] können die Tröpfchen in eine elektrisch neutrale innere „Haufenphase“ und eine Phase mit geladener Oberfläche eingeteilt werden. Oberflächenaktive Analyten (ASA +) besetzen die geladenen Stellen schneller als nicht-oberflächenaktive Analyten (ANSA +) und es sind vor allem die oberflächenaktiven Analyten, die in den Massenspektren beobachtet werden.

Die Massenspektrometrie (MS) beruht auf der Manipulation von Ionen in der Gasphase auf der Grundlage ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses (m/z) mithilfe von elektrischen und magnetischen Feldern. Sie ist eine sehr leistungsstarke, weit verbreitete und vielseitige Technik für quantitative und qualitative Analysen, die nach der Art des Trennvorgangs unterschieden wird. In diesem Artikel wird ein kurzer Abriss der Ionenerzeugung bei den häufig eingesetzten Verfahren der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC/MS) und der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC/MS) gegeben. Auch werden die Gründe genannt, aus denen eine Beseitigung von Interferenzen durch unterschiedliche Probenvorbereitungstechniken entscheidend für eine optimale Leistung ist.

Derzeit sind GC/MS und LC/MS der Goldstandard für die analytische Bestimmung eines Analyten in einem komplexen Gemisch („Matrix"). Diese außerordentlich leistungsstarken Techniken erfordern vor der Probenaufgabe jedoch häufig eine zusätzliche Probenvorbereitung. Für optimale Arbeitsabläufe mit einem Maximum an Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit ist die Vorbereitung der Proben von entscheidender Bedeutung. Die Anregung zu diesem Artikel stammt aus der neuen virtuellen Spezialausgabe des Journal of Separation Science (JSS) zum Thema „Sample Preparation for Mass Spectrometry" (Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie), die vom Verfasser zusammen mit Prof. Michael Lämmerhofer von der Universität Tübingen herausgegeben wurde (s. [1] ). Der vorliegende Artikel enthält eine allgemeine Einführung in die Grundlagen der Massenspektrometrie und die erforderliche Probenvorbereitung. Mit diesen Informationen kann der Leser die Vielzahl von detaillierten Forschungsartikeln nutzen, die von der Website des JSS heruntergeladen werden können.

Ionenerzeugung
Bevor Ionen getrennt und mithilfe eines Massenspektrometers analysiert werden können, müssen sie zunächst erzeugt und in die Gasphase überführt werden. Für jede Probenart (fest, flüssig oder gasförmig) gibt es eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Erzeugung von Ionen.

Frühe Studien von J. J. Thompson (dem „Vater der Massenspektrometrie") Ende des 19. bzw. Anfang des 20. Jahrhunderts wurden mit Gasentladungen in einem geschlossenen Apparat durchgeführt. Die auf diese Weise erzeugten Ionen wurden durch Anlegen eines elektrischen Feldes beschleunigt und anschließend elektrischen und magnetischen Feldern ausgesetzt, die die Ionenbahnen in Abhängigkeit vom jeweiligen Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) ablenken oder beugen. Eine hervorragende und umfassende Darstellung der Geschichte der Massenspektrometrie enthält das Buch von Grayson aus dem Jahr 2002 [2].

Bis weit in die erste Hälfte des 20. Jahrhunderts wurde die Massenspektrometrie von Ionenphysikern durchgeführt. Mitte der 1950er-Jahre begann mit der Verbindung von Massenspektrometrie und Gaschromatographie (GC) das moderne Zeitalter der Massenspektrometrie - in den Laboren von analytischen Chemikern und Benutzereinrichtungen für eine große Bandbreite von Dienstleistungen zur Unterstützung einer Vielzahl von unterschiedlichen Forschungsvorhaben. Mit der Gaschromatographie ist es möglich, Proben halbflüchtiger und (meist) in flüchtigen Lösemitteln enthaltener flüchtiger Analyten leicht zu trennen und mittels Massenspektrometrie zu analysieren. Indem die jeweiligen Analyten in einem Lösemittel gelöst und anschließend in ein GC/MS- oder LC/MS-Gerät eingebracht werden, können verschiedene feste und flüssige Proben analysiert werden. Feste Proben können auch anderen Verfahren zur Erzeugung von Ionen wie beispielsweise Laserstrahlung ausgesetzt werden. In den letzten zehn Jahren sind mit der Entwicklung neuer Techniken zur Ionisation bei Atmosphärendruck die Möglichkeiten zur Umwandlung von Analyten in Ionen in der Gasphase erstaunlich erweitert worden [3].

Eine Erörterung der mit der Vielzahl von unterschiedlichen Techniken zum Erzeugen von Ionen verbundenen Mechanismen würde den Umfang dieses Artikels überschreiten, daher sollen hier nur die am häufigsten eingesetzten Verfahren - die Elektronenstoßionisation (EI) für GC/MS und die Elektrospray-Ionisation (ESI) für LC/MS - beschrieben werden. In der Literatur werden für GC/MS- und LC/MS-Anwendungen nach wie vor hauptsächlich diese beiden Ionenquellen genannt. Sie sind sehr vielseitig und eignen sich sehr gut für eine große Bandbreite von unterschiedlichen Analyten.

Elektronenstoßionisation
Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung der Elektronenstoßionisation (EI). Der Auslass der GC-Säule befindet sich dicht neben einem speziellen Ionisationsdraht, der die Analyten mit Elektronen einer Energie von 70 eV beschießt. Diese hohe Energie führt dazu, dass organische Moleküle ionisiert werden und Fragment-Ionen entstehen. Eine Energie von 70 eV wird verwendet, weil die Fragmentierung auf diese Weise bei der Vielzahl von unterschiedlichen Instrumentenplattformen und Analyten mit unterschiedlichen Ionisationspotentialen einheitlich ist. Daher enthalten Massenspektralbibliotheken Hunderttausende von Massenspektren unterschiedlicher Verbindungen, die die Ermittlung der Signale von unbekannten Verbindungen erleichtern sollen. Abbildung 1B zeigt den Beginn der Ionisierung (Erzeugung des Ionenstroms) und die Fragmentierung eines beliebigen Moleküls. Die Ionisierung beginnt, sobald das Ionisierungspotential des Moleküls überschritten wird. Je stärker die Elektronenenergie ansteigt, desto größer wird die Anzahl der Ionen und schließlich der Fragment-Ionen. Beim Erreichen von 70 eV wird, (zumeist) unabhängig von der Molekülart, ein Plateau gleichbleibender Ionenerzeugung und Fragmentierung erreicht.

Mithilfe der Elektronenstoßionisation wird eine große Anzahl von Fragmenten erzeugt. Dieses Ionisierungsverfahren wird häufig als „harte" Ionisierungstechnik bezeichnet. Die Elektronenstoßionisation ist auch vergleichsweise unempfindlich gegenüber Matrixeffekten, d. h. bei der gleichzeitigen Ionisierung von mehreren unterschiedlichen Bestandteilen hat die Ionisierung eines Bestandteils in der Regel keine großen Auswirkungen auf die Ionisierung eines anderen Bestandteils. Diese Aussagen gelten natürlich nur innerhalb bestimmter Grenzen. Eine andere GC-Ionisierungstechnik ist zum Beispiel die chemische Ionisation (CI), bei der die EI-Quelle mit einem Reaktantgas (z. B. Methan oder Ammoniak) geflutet wird (d. h. einem Überschuss an Reaktantgas im Vergleich zur Menge des Analyten), das die Ionisierung der Analyten erheblich verändert. Matrixeffekte sind zwar kein großes Problem für die Elektronenstoßionisation, dennoch ist es für die quantitative Analyse und die Erzeugung von geeigneten Signalen wichtig, dass die Analyten vor der Ionisierung wirkungsvoll getrennt werden. Treten gleichzeitig mehrere koeluierende Analyten in die Ionenquelle ein, wird das beobachtete Massenspektrum eine Mischung aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Signalen sein. Es wäre sehr schwierig, ein derartiges Spektrum in der Bibliothek zu finden, um eine der Komponenten zu ermitteln. Womöglich wäre nicht einmal bekannt, dass die Komplexität des Spektrums durch Koelution erhöht ist. Eine wirkungsvolle chromatographische Trennung ist daher ein sehr wichtiger Schlüsselfaktor für die Messung sauberer Spektren (d. h. die Ermittlung aller Verbindungen eines Gemischs); doch auch die Probenvorbereitung ist nach wie vor sehr wichtig, um Interferenzen auszuschließen. Diese Interferenzen können nicht nur zu einer Koelution und Konvolution von Massenspektren führen, sondern ihre Auflösung im heißen Injektionsport des GC kann auch die Lebensdauer der Beschichtung der Säulen und des Injektionsports verkürzen und auf diese Weise Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit beeinträchtigen. Bei der GC/MS ist die Probenvorbereitung daher einerseits sehr wichtig, um die ordnungsgemäße Funktion des GC-Systems zu gewährleisten, andererseits ist sie erforderlich, um sicherzustellen, dass qualitativ hochwertige Massenspektren erzeugt werden können.

Elektrospray-Ionisation
Bei der Elektrospray-Ionisation (ESI) ist die Lage etwas komplizierter. Die ESI, die in der Regel als Ionisationsquelle für LC/MS eingesetzt wird, ist eine „weiche" Ionisationstechnik (d. h. die Analyten werden nur minimal fragmentiert) und sehr anfällig für Matrixeffekte. Abbildung 2A zeigt den typischen Aufbau einer ESI-Quelle. An der Spitze einer Kapillare, an der ein hohes Potenzial anliegt, wird ein Nebel aus hoch geladenen Tröpfchen erzeugt. Das elektrische Feld an der Oberfläche der Kapillare führt zu einer Ladungstrennung und beim Versuch der überschüssigen Ladung, die unter Atmosphärendruck stehende Sprüh- oder Quellkammer zu durchqueren, um zum Eingang des Massenspektrometers zu gelangen, werden Tröpfchen geformt. Während des Vorgangs verlieren die Tröpfchen durch Verdampfung so lange Lösemittel, bis sie sich teilen müssen, weil die Ladungsabstoßung an der Oberfläche der Tröpfchen stärker wird als die Oberflächenspannung, die die Tröpfchen zusammenhält. Nach mehreren Teilungen ist es für diejenigen Analytspezies, die an die Oberfläche der Tröpfchen gewandert sind und Ladung aufgenommen haben, günstiger, sich von der Oberfläche der Tröpfchen zu lösen (zu verdampfen) und schließlich als Ionen in die Gasphase überzugehen. Abbildung 2B zeigt das Konzept des Verteilungsgleichgewichtsmodells [4], das die konkurrierende Wanderung der Ionen der Analytspezies vom Inneren der Tröpfchen an die geladene Oberfläche der Tröpfchen gut beschreibt. Die Tröpfchen durchlaufen also gewissermaßen zwei Phasen - eine elektrisch neutrale innere „Haufenphase" und eine Phase mit geladener Oberfläche. Oberflächenaktive Analytspezies konkurrieren um eine begrenzte Anzahl von geladenen Stellen an der Oberfläche der Tröpfchen. Die gemessene Ionenintensität ist proportional zur Konzentration des Analyten an der Oberfläche der Tröpfchen (und nicht proportional zur Gesamtkonzentration des Analyten in den Tröpfchen). Das bedeutet, dass der Wettbewerb um die geladenen Stellen an der Oberfläche der Tröpfchen das Signal des zu bestimmenden Analyten begrenzen kann (ebenso können Matrixeffekte die Signalintensität erhöhen), wenn die ESI-Tröpfchen nicht nur den zu bestimmenden Analyten, sondern auch noch andere Analytspezies enthalten.

Die begrenzenden Matrixeffekte bei der ESI sind absolut wesentlich für die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit der quantitativen Analyse mittels LC/MS. Blut-Plasma und -Serum enthalten große Mengen Phospholipide, und Phospholipide sind von Natur aus oberflächenaktive Verbindungen. Daher können sie den zu bestimmenden Analyten wirkungsvoll verdrängen, wenn sie sich im gleichen ESI-Tröpfchen befinden (das Gleiche kann passieren, wenn man Glasbehälter mit Seife reinigt. Aus diesem Grund dürfen Glasbehälter, in die Lösungen für MS-Analysen gefüllt werden, niemals mit Seife gereinigt werden). Im Biomonitoring ist die Probenvorbereitung außerordentlich wichtig, um eine Koelution von in großer Menge vorhandenen Salzen, Lipiden und Proteinen und dem zu bestimmenden Analyten zu begrenzen. Die Anwendung eines internen Standards kann natürlich die Präzision verbessern und zur Signalunterdrückung beitragen, dennoch kann a) ein Signal weiterhin verloren gehen, wodurch die Gesamtempfindlichkeit der Methode beeinträchtigt werden würde, und b) es muss eine stabile, isotopisch gekennzeichnete Version des Analyten als interner Standard vorhanden sein (Ist dies der Fall? Wenn ja, was kostet er?), damit für das ESI-Tröpfchen genau die gleichen Umgebungsbedingungen gelten wie für den zu bestimmenden Analyten. Zunächst ist also genau zu überlegen, was sich noch in der Probe befindet, anschließend muss ein geeignetes Schema zur Vorbereitung der Probe entwickelt werden, um ein Eintragen von Matrixkomponenten in das LC-MS zu begrenzen, die die Leistung beeinträchtigen könnten.

Auswirkungen auf die Probenvorbereitung
Es ist unrealistisch, die Vielzahl der Möglichkeiten zur Probenvorbereitung in einer Monographie darzustellen. Zu den einfachen und gebräuchlichen Verfahren zur Behandlung von flüssigen Proben, insbesondere wässrigen Umweltproben oder biologischen Proben, gehören die Flüssig/Flüssig-Extraktion, die Festphasen-Extraktion und die Proteinfällung. Bei Feststoffproben sind Lösemittel-Extraktion und Soxhlet-Extraktion gebräuchlich. Bei gasförmigen Proben werden die Bestandteile entweder von einem festen Sorptionsmittel adsorbiert oder direkt in einem Behälter gesammelt. All diese Verfahren haben ihre Vor- und Nachteile in Bezug auf Zeit, Kosten, Anreicherung, Rückgewinnung usw. Weiterhin ist es möglich, unterschiedliche Verfahren zur Probenvorbereitung nacheinander anzuwenden. Um die Anzahl der menschlichen Eingriffe möglichst gering zu halten, können Online- oder Offline-Verfahren eingesetzt werden. Insgesamt ist zu beachten, dass die Probenvorbereitung nicht nur kritisch für die Optimierung von Präzision, Genauigkeit und Empfindlichkeit einer Methode ist, sondern auch der Schritt, der häufig zu den größten Fehlern einer Analyse führt. Je mehr Schritte eine Probenvorbereitung also umfasst, desto schlechter wird demnach die Präzision der gesamten Methode sein. Aus diesem Grund sollte jeder Bericht über quantitative Methoden zur Spurenanalyse in der Literatur auch immer eine umfassende Validierung der Methoden enthalten. Auf diese Weise wird es dem Endnutzer ermöglicht, Leistung, Vorteile und Grenzen einzelner Arbeitsabläufe problemlos miteinander zu vergleichen. Häufig sind es Verbesserungen dieser Parameter, insbesondere dann, wenn in kürzerer Zeit eine höhere Empfindlichkeit bei geringeren Kosten erreicht werden kann, die eine neue Methode von älteren Methoden abheben und zu ihrem Erfolg beitragen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es sich bei der Massenspektrometrie um eine außerordentlich vielseitige Technik handelt, mit zunehmender Komplexität der Proben jedoch immer größere Anstrengungen zur Trennung der Bestandteile des Gemischs mittels Probenvorbereitung und hocheffizienter Trennung vor der Massenanalyse unternommen werden müssen. Denken Sie bei Ihrem Blick in die virtuelle Spezialausgabe des JSS auch daran, wie die Innovationen im Bereich der Probenvorbereitung zur Entwicklung neuer Leistungsmessungen für unterschiedliche Probenarten und Analyten beigetragen haben. In diesem Forschungsbereich wird ein Mehr an Innovation stets sehr begrüßt werden. Es wird immer neue Herausforderungen geben, die darauf warten, gemeistert zu werden.

Literatur
[1] Virtual Special Issue 2014, Journal of Separation Science, http://bit.ly/SamplePrepMS
[2] Grayson M. A.: Chemical Heritage Press, Philadelphia, PA. (2002)
[3] Monge M.E. et al.: Chem. Rev. 113, 2269-2308 (2013)
[4] Enke C.G.: Anal. Chem., 69, 4885-4893 (1997)

Kontakt
Kevin A. Schug, Ph.D.
Associate Professor & Shimadzu Distinguished
Professor of Analytical Chemistry
Department of Chemistry & Biochemistry
The University of Texas at Arlington
Arlington, TX, USA

Virtual Special Issue des Journal of Separation Science
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