Probenvorbereitung für die LC-MS basierte Metabolomik und Lipidomik

Optimale Ergebnisse durch optimale Probenvorbereitung

  • Tab. 1: Löslichkeit von NaCl in organischen Lösungsmitteln. Werte aus [2].Tab. 1: Löslichkeit von NaCl in organischen Lösungsmitteln. Werte aus [2].
  • Tab. 1: Löslichkeit von NaCl in organischen Lösungsmitteln. Werte aus [2].
  • Abb. 1: Plot der exakten Masse gegen den logP für Metaboliten aus der Human Metabolome Database. Gezeigt sind Metaboliten mit meinem logP zwischen -20 und 35. Die Pfeile stellen den typischen Polaritätsbereich einiger chromatographischer Methoden dar.
  • Tab. 2: Übersicht über gängige Exktraktionsmethoden für die Metabolomik und LIpidomik.
  • Abb. 2: Extrahierte Ionenchromatogramme für einen Matrixpeak (m/z 104.9947), HEPES (m/z 239.1060) und Acetyl-CoA (m/z 810.1330).
Die Metabolomik und die Lipidomik haben zum Ziel alle Metabolite bzw. Lipide ( = Metabolome oder Lipidome) in einem biologischen System zu charakterisieren und ultimativ zu quantifizieren. Die Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an die Massenspektrometrie (engl. Liquid Chromtagraphy – Mass Spectrometry, LC-MS) wird oft eingesetzt, um diese Ziele zu erreichen.
 
Ein wichtiger Punkt ist hier jedoch zu beachten: Metabolite decken einen großen Polaritätsbereich ab. Als Anhaltspunkt für die Polarität von Metaboliten und Molekülen im Allgemeinen dient der Verteilungskoeffizient zwischen Wasser und Oktanol oder der negative dekadische Logarithmus logP. Um einen Überblick über den möglichen Polaritätsbereich zu gewinnen, zeigt Abbildung 1 die exakte Masse gegen den logP aller in der „Human Metabolome Database“ [1] gespeicherten Metaboliten in einem von logP = -20 bis logP = 35 aufgetragen. Die Histogramme an den Achsen vermitteln hierbei einen Einblick in die Anzahl der Metaboliten. Beispiele für Metabolite mit extremen logP-Werten sind ATP mit logP = -6.00 oder das Lipid Tripalmitin (TG(16:0/16:0/16:0)) mit einem logP = 18.9. Zum Vergleich sind über dem Histogramm für die logP-Werte die Polaritätsbereiche von verschiedenen chromatographischen Methoden abgebildet. Keiner Analysenmethode, bzw. Exktraktionsmethode ist es möglich diesen kompletten Bereich abzudecken. Je nach Ziel der Analyse und Bereich der Zielanalyten müssen verschiedene Probenvorbereitungs- und Extraktionsmethoden angewandt werden. Um eine optimale und aussagekräftige Probe für die LC-MS basierte Metabolomik und Lipidomik zu erhalten, sind vor der Probenvorbereitung und der anschließenden Analyse einige Punkte zu beachten, welche hier im Weiteren diskutiert werden sollen.
 
Probengewinnung
Der erste Schritt in der Probenvorbereitung für die Metabolomik und Lipidomik stellt die Probengewinnung dar. Um korrekte Ergebnisse zu erhalten, ist es notwendig den Stoffwechsel, sprich die metabolischen Enzyme möglichst vollständig zu deaktivieren, um ein akkurates Bild der Konzentrationen der Metabolite zu erhalten.

Viele Metabolite besitzen eine hohe intrazelluläre Umsatzrate, z.B. hat ATP einen Umsatz von 1.5 mM/s. Das Stoppen des Stoffwechsels wird durch kalte Lösungsmittel, Hitzedenaturierung der Enzyme oder verschiedenen denaturierenden Chemikalien erreicht. Diese Denaturierung ist besonders wichtig für die Messung von Metaboliten des zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsels, da hier besonders hohe Umsetzungsraten der Fall sind. Im Falle des sekundären Stoffwechsels sind diese meist geringer, sodass der Einfluss ebenfalls geringer ausfällt. Die chemische Stabilität der Metabolite ist ebenfalls zu beachten. Proben werden am besten bei kalten oder tiefkalten Temperaturen aufbewahrt, um eine Zersetzung von Metaboliten zu unterdrücken.

Weitere Schritte, die während der Probengewinnung zu beachten sind, sind der Gehalt an evtl. störenden Substanzen die evtl. in Kulturmedien etc. vorhanden sein könnten. Ebenso stellen Salze ein weiteres Problem dar. Es ist nicht zu unterschätzen wieviel Salz sich noch in organischen Lösungsmitteln lösen. Zum Vergleich ist die Löslichkeit von NaCl in verschiedenen Lösungsmitteln in Tabelle 1 dargestellt. Abbildung 2 zeigt wie Salze aus der Probengewinnung die nachfolgende Analytik stören können. Um evtl. störendes Zellkulturmedium zu entfernen, wurden Zellen entweder mit H2O, PBS oder einem HEPES-Puffer gewaschen. Zielanalyt war in diesem Fall Acetyl-CoA. Acetyl-CoA eluiert in der Nähe eines Matrixpeaks, welcher aus Na-Formiate-Clustern besteht. Ist dieser Matrixpeak zu groß, wird das Acetyl-CoA in seiner Ionisierung unterdrückt und ist nicht mehr im MS detektierbar. In der mit H2O gewaschenen Probe lässt sich Acetyl-CoA detektieren (m/z 810.1330) während bei den PBS und HEPES gewaschenen Proben zu viel Salz vorhanden ist, was zu einer Unterdrückung des Acetyl-CoA-Signals führt. Salz haltige Puffer sollten daher nur sehr sparsam eingesetzt werden, bzw. eine Abtrennung der Salze in der chromatographischen Methode oder in weiteren Probenvorbereitungsschritten vorgesehen werden. Selbst wenn Salze selbst die Analytik der Zielmetaboliten nicht beeinflussen, stören sie im MS und können dort in der Ionenquelle ausfallen, was zu verminderter Ionisierungseffizienz oder im schlimmsten Fall zum Ausfall das Gerätes führen könnte.
 
Homogenisierung und Extraktion
Je nach Beschaffenheit der Probe müssen weitere Schritte in der Probenvorbereitung unternommen werden. Hierzu zählen die Homogenisierung von festen Proben, die Entfernung störender Proteine und die eigentliche Extraktion der Metabolite. Feste Proben wie Gewebe müssen vor der eigentlichen Extraktion homogenisiert werden. Dies geschieht durch Mahlen oder in sog. Bead-Beating-Systemen. Auch bei diesem Schritt ist zu beachten, dass Metabolite sich evtl. zersetzen können. Daher erfolgt das Mahlen oft unter tiefkalten Temperaturen, z.B. unter flüssigem Stickstoff. Bei Bead-Beating-Systemen können durch Reibungshitze auch höhere Temperaturen in der Probe erreicht werden, ein gekühltes System ist hier von Vorteil, um einen Abbau von Metaboliten zu verhindern.
Viele verschiedene Exktraktionsmethoden wurden für die Metabolomik und Lipidomik entwickelt. Ziel ist es, jeweils möglichst viele Metabolite quantitativ zu extrahieren. Je nach Zielanalyten müssen verschiedene Exktraktionsmethoden gewählt werden, es gibt keine Methode, die alle Metabolite gleich effizient extrahiert. Neben der Löslichkeit der Analyten ist deren Stabilität ein weiterer wichtiger Faktor zur Auswahl einer passenden Exktraktionsmethode. Einige Extraktionsmethoden arbeiten bei extremen pH-Werten, um entweder Metabolite zu stabilisieren oder Proteine zu denaturieren. Hierbei ist zu beachten, dass Metabolite die jeweils bei andere pH-Werten stabil sind evtl. zersetzt werden. Dies führt nicht nur dazu, dass diese Metabolite nur schlecht oder gar nicht detektiert werden und evtl. Abbauprodukte zu finden sind. Daraus könnten evtl. falsche Schlüsse für die Biologie der Proben gezogen werden. Daher sollten Extraktionsmethoden immer im Bezug auf die Wiederfindungsrate von Zielmetaboliten, z.B. durch isotopenmarkierte Standards, evaluiert werden.
 
Weitere Aufarbeitungsschritte
Festphasenextraktion
In einigen Fällen ist es notwendig weitere Matrixbestandteile oder störende Substanzen von den Zielmetaboliten abzutrennen. Die Festphasenextraktion (engl. Solid Phase Extraction, SPE) ermöglicht eine weitere Aufreinigung. Viele verschiedene Phasen sind für die SPE erhältlich und eignen sich auch für die Probenvorbereitung in der Metabolomik und Lipidomik. Durch die Verwendung der SPE werden oft sehr saubere und sehr definierte Extrakte erhalten. Allerdings können durch diesen zusätzlichen Schritt einige Metabolite verloren gehen, die nicht an die SPE binden.
 
Resuspendierung von Extrakten
Da die erhaltenen Proben oft nicht für eine direkte Analytik geeignet sind, müssen verschiedene weitere Schritte durchgeführt werden, wie z.B. die Entsalzung oder ein Lösungsmittelwechsel. Das Injektionslösungsmittel hat großen Einfluss auf die Qualität der chromatographischen Trennung. Während eine Resuspendierung in dem Startlaufmittel wünschenswert ist, lösen sich oft viele Metabolite nur schlecht im diesem schwachen Laufmittel. Daher wird oft je nach Anforderung in anderen Lösungsmitteln die Probe rückgelöst. Wichtig ist hierbei jedoch die Form der chromatographischen Peaks im Auge zu behalten. Zu hohe Konzentration an starken Lösungsmitteln können zur Verformung der Peaks führen, während zu schwache Lösungsmittel Substanzen von Interesse nicht zu 100% lösen. Dies stellt besonders bei der Lipidomik ein besonderes Problem dar, da viele Lipide nur in starken Lösungsmitteln wie iso-Propanol oder Chloroform löslich sind. Danne-Rasche et al. haben dieses Phänomen im Zuge ihrer Arbeit zur nanoLC-MS in der Lipidomik untersucht [3]. Während zum Beispiel eine Mischung aus Butanol, iso-Propanol und H2O zu guten Peakformen führte, löste sich der Standard TG(14:0/14:0/14:0) nicht zu 100% in dieser Mischung. Viele der anderen Lösungsmittel führten zwar zu besserer Löslichkeit dieser Substanz, aber zu schlechteren Peakformen für die Standards LPS(17:1) und PG(17:0/14:1) [3]. Ein ähnliches Problem ist bei der Verwendung von HILIC zu beobachten. Hier sind die Startkonditionen typischerweise 80-95% ACN. Viele polare Substanzen sind hier nur schlecht löslich. Probleme mit der Peakform betreffen meist früh eluierende Subtanzen stärker als später eluierende.
Filtration oder Zentrifugation
Da sich nicht immer alles Stoffe, Salze etc. komplett in dem gewählten Lösungsmittel zurücklösen, müssen weitere Schritte zur Gewinnung einer LC-MS tauglichen Probe unternommen werden. Gerade bei der Verwendung der UHPLC ist es besonders zu empfehlen, wenn die Proben vor der Analyse durch 0.22 µm-Filter von Partikeln befreit werden, welche sonst zur Verstopfung der Säule führen können. Im Falle von sehr geringen Probevolumina ist eine Zentrifugation bei hohen G-Zahlen empfehlenswert, um evtl. vorhandene Partikel zu präzipitieren und den Überstand in ein entsprechendes Probengefäß zu überführen. Es ist zu beachten, dass evtl. Niederschläge sich auch in gekühlten Autosampler über längere Zeit bilden können.
 
Zusammenfassung
Die Probengewinnung und -vorbereitung hat einen großen Einfluss auf die Qualität und die Ergebnisse der anschließenden Analytik. Um optimale Ergebnisse in der Metabolomik und Lipidomik zu erhalten ist es wichtig die genannten Eckpunkte zu überdenken und evtl. weitere Experimente zur Optimierung vor dem eigentlichen Experiment durchzuführen. Es sollte jedoch immer beachtet werden, dass die gewählte Method meist einen Kompromiss darstellt, da der weitere Polaritätsbereich nicht komplett optimiert werden kann.

 

Autor
Michael Witting1,2

Zugehörigkeiten
1 Helmholtz Zentrum Muenchen, Department of Environmental Sciences (DES), Analytical BioGeoChemistry (BGC), Neuherberg, Deutschland
2 TU München, Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt, Lehrstuhl für Analytische Lebensmittelchemie, München, Deutschland

Kontakt
Dr. Michael Witting

Helmholtz Zentrum Muenchen
Department of Environmental Sciences (DES)
Analytical BioGeoChemistry (BGC)
Neuherberg, Germany
michael.witting@helmholtz-muenchen.de
 

Literatur
[1] Wishart, D.S., et al., HMDB 4.0: the human metabolome database for 2018. Nucleic Acids Research, 2018. 46(D1): p. D608-D617.
[2] Burgess, J., Metal ions in solution. 1978: Ellis Horwood.
[3] Danne-Rasche, N., C. Coman, and R. Ahrends, Nano-LC/NSI MS Refines Lipidomics by Enhancing Lipid Coverage, Measurement Sensitivity, and Linear Dynamic Range. Analytical Chemistry, 2018. 90(13): p. 8093-8101.

 

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