Raman-Spektroskopie in der Klinik

Potential und Grenzen

  • Abb. 1: Raman-Spektren der biologischen Hauptbestandteile von Bakterien: Wasser, Protein, Nukeinsäuren (DNA), Kohlenhydrate und Fette. In den beispielhaft gezeigten Raman-Spektren verschiedener Staphylokokken-Stämme lassen sich verschiedene Banden der Einzelbestandteile erkennen.Abb. 1: Raman-Spektren der biologischen Hauptbestandteile von Bakterien: Wasser, Protein, Nukeinsäuren (DNA), Kohlenhydrate und Fette. In den beispielhaft gezeigten Raman-Spektren verschiedener Staphylokokken-Stämme lassen sich verschiedene Banden der Einzelbestandteile erkennen.
  • Abb. 1: Raman-Spektren der biologischen Hauptbestandteile von Bakterien: Wasser, Protein, Nukeinsäuren (DNA), Kohlenhydrate und Fette. In den beispielhaft gezeigten Raman-Spektren verschiedener Staphylokokken-Stämme lassen sich verschiedene Banden der Einzelbestandteile erkennen.
  • Abb. 2: Mikrofluidikchip aus Quarz für die Raman-aktivierte Zellsortierung.
  • Abb. 3: Vergleich von TPEF-, CARS und Raman-Mikroskopie eines ungefärbten Hirntumordünnschnittes mit dem lichtmikroskopischen Bild des nachträglich Hämatoxylin und Eosin gefärbten Präparats.
  • Abb. 4: Raman-endoskopische Untersuchung der Arterien eines Kaninchens
  • © Mopic - Fotolia.com

Die Raman-Spektroskopie ist dank ihrer molekularen Sensitivität eine vielversprechende Methode zur Lösung von klinisch relevanten Herausforderungen im Bereich der Pathogen-Diagnostik, der Onkologie und im Bereich der kardiovaskulären Krankheiten. Entsprechende Lösungsansätze werden im Artikel vorgestellt.

Einleitung
Im 21. Jahrhundert stehen wir angesichts einer zunehmenden Überalterung der Bevölkerung vor der Herausforderung bezahlbare und nachhaltige Gesundheitssysteme zu gewährleisten. Um dieser Herausforderung zu begegnen, bedarf es der Entwicklung neuer Methoden und Geräte, mit denen Krankheiten am besten schon vor ihrer Entstehung entdeckt und bekämpft werden können. Eine Schlüsselstellung nimmt hier die Photonik ein. Eine besonders vielversprechende und vielseitige photonische Methode stellen die Raman-Spektroskopie und ihre Varianten dar. Wie generell alle auf Licht basierenden Methoden erlaubt die Raman-Spektroskopie eine kontaktfreie Messung, die aber im Gegensatz z. B. zur Fluoreszenz-Spektroskopie auch noch ohne exogene Label auskommt. Dadurch hat die Raman-Spektroskopie das Potential eine patientennahe Diagnostik zu ermöglichen, insbesondere da sie nicht nur eine vergleichsweise schnelle, sondern auch sehr präzise Methode darstellt. Besonders im Bereich der bildgebenden Methoden sind die hohe Spezifität und die geringe Invasivität hervorzuheben. Weiterhin sprechen für die Raman-Spektroskopie die hohe räumliche Auflösung, die fehlende Notwendigkeit einer aufwändigen Probenpräparation und die Möglichkeit im wässrigen Milieu zu arbeiten.
Im Folgenden werden einige exemplarisch ausgewählte und besonders vielversprechende Anwendungsmöglichkeiten der Raman-Spektroskopie im medizinischen und klinischen Bereich vorgestellt.

Pathogen-Diagnostik
Die klassische Pathogen-Diagnostik beruht auf dem Ansetzen und der Analyse einer Pathogen-Kultur, was bis zu einer Woche erfordern kann und erfahrenes Fachpersonal benötigt. Bei manchen Infektionen und wenn sie sich zur Sepsis weiterentwickeln, verringert sich die Überlebensrate drastisch mit jeder Stunde die vergeht, bevor eine gezielte Behandlung möglich ist.

Der Idealfall wäre, dass eine Infektion binnen weniger Stunden einem Pathogen zugeordnet werden kann. Da jede Bakterienspezies über eine individuelle Raman-Signatur verfügt, bietet sich die Raman-Spektroskopie zur Identifizierung von Bakterien an, wobei das Spektrum eines einzelnen Bakteriums bereits zur Identifikation ausreicht. Allerdings sind die Unterschiede zwischen den Spektren verschiedener Spezies oft subtil und eine Zuordnung nach dem Augenschein nicht möglich. Das Bakterienspektrum ist letztendlich die Summe der spektralen Signaturen aller enthaltenen Stoffe wie Wasser, Proteine, Fette, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate etc. (Abb. 1).
Selbst zwischen den Spektren verschiedener Bakterien ein und derselben Spezies existieren deshalb subtile Unterschiede, bedingt z. B. durch Alter, Ernährungszustand und unterschiedliche Umwelteinflüsse. Die Lösung dieses Problems besteht in der Anwendung von chemometrischen Methoden auf die Raman-Spektren der Bakterien. Dabei wird ein Spektrum, vereinfacht ausgedrückt, in besonders markante Bereiche zerlegt und diese mathematisch mit äquivalenten Bereichen von in einer umfangreichen Datenbank gesammelten Bakterien-Spektren verglichen. Im Schnitt lässt sich dabei nicht nur von beinahe 99 % der Bakterien die Spezies korrekt bestimmen, sondern sogar die Stammzugehörigkeit innerhalb einer Spezies mit einem Durchschnittswert von mehr als 92 % [1]. Zur Bestimmung von Kontaminationen in Reinräumen oder in Klimaanlagen ist eine entsprechende Lösung bereits kommerziell erhältlich (Biopartikelexplorer, Rapid Particle Systems). Diese nutzt die Fluoreszenzspektroskopie, um zwischen unbelebten Partikeln und Bakterien zu unterscheiden. Die Bakterien werden dann mittels Raman-Spektroskopie identifiziert. Der Einsatz in der Klinik macht es jedoch notwendig, Bakterien in komplexeren Medien wie Speichel, Urin oder gar Blut zu bestimmen. Dazu müssen die Bakterien von diesen Medien separiert werden, da sonst das Medium die Identifikation erschwert bzw. unmöglich macht. Für diesen Abtrennungsschritt werden momentan mikrofluidische Chips entwickelt, welche sich beispielsweise der Dielektrophorese bedienen, um Bakterien einzufangen und der Messung zugänglich zu machen [2]. Letztere Methode kann aber auch dazu benutzt werden, Bakterien direkt in Lösung zu vermessen, und erlaubt es damit, neben der Identifikation, z. B. auch noch Aussagen über die Anfälligkeit bzw. Resistenz gegenüber Antibiotika zu treffen.

Onkologische Diagnostik
Von einem kanzerogenen Gewebe können sich Tumorzellen lösen, welche schließlich in den Blutstrom gelangen und letztendlich Metastasen auslösen können. Diese vereinzelten Tumorzellen sind verhältnismäßig gut zugänglich und verfügen über einen großen diagnostischen Wert. Das diagnostische Prinzip entspricht im Wesentlichen dem der optischen Fluss-Sortierung. Das Blut wird durch einen mikrofluidischen Chip geleitet. Einzelne Zellen im Blutstrom werden durch optische Fallen eingefangen, mit Hilfe der Raman-Spektroskopie untersucht und klassifiziert, und zur weiteren Verwendung sortiert. Im Unterschied zur optischen Fluss-Sortierung ist indes mittels Raman eine wesentlich genauere Diagnostik der Einzelzelle möglich. Allerdings erkauft man sich diesen Vorteil mit einem wesentlich geringeren Durchsatz (5 - 6 Zellen / Minute), der aber zukünftig über gerätetechnische Verbesserungen noch deutlich verbessert werden kann. Abbildung 2 zeigt einen Mikrofluidik-Chip aus Quarz für die Raman-aktivierte Zellsortierung [3]. Einzelne Zellen werden durch Laser in einer optischen Falle gefangen. Nach einer Raman-basierten Identifikation kann die Zelle einer Sortierung zugeführt werden. Die unprozessierten Raman-Spektren werden durch die spektralen Eigenschaften von Filtern, des Fanglasers und Substratmaterials beeinflusst. Eine erfolgreiche Klassifizierung erfordert deshalb eine Unterdrückung dieser Eigenschaften, damit der spektrale Fingerabdruck von weißen Blutzellen (grün) und Tumorzellen (orange, braun, blau) sichtbar wird.

Insbesondere bei Gehirntumoren ist eine radikale Tumorentfernung nicht ratsam. Stattdessen sollte möglichst wenig gesundes Gewebe entfernt werden. Jedoch sind die Grenzen zwischen Tumor und gesundem Gewebe oft diffus. Bislang wird entnommenes Gewebe im OP von einem Pathologen beurteilt und aufgrund dieser Beurteilung entschieden, ob der Tumor entfernt werden muss. Wünschenswert dagegen wäre ein Operationsmikroskop, das die Grenzen des Tumors direkt abbildet. Ein solches Mikroskop könnte über die Kombination mehrerer bildgebender Techniken verwirklicht werden. Dabei werden mehrere, vorzugsweise Label-freie Techniken miteinander kombiniert, um den Kontrast zu verstärken. Als besonders aussichtsreich gilt die Kombination von Raman mit kohärenter Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS), der Zwei-Photonen Fluoreszenzanregung (TPEF) unter Verwendung endogener Marker und der „Second Harmonic Generation" (SHG) [4]. Während bei der Raman-Streuung alle (Raman-aktiven) Schwingungsmoden gleichzeitig angeregt werden, wird bei CARS durch die Wechselwirkung von drei verschiedenen Lichtpulsen eine ausgewählte Schwingung isoliert und kohärent angeregt, wobei ein vierter, räumlich gerichteter und kohärenter Lichtpuls generiert wird. Der Vorteil gegenüber Raman-Imaging liegt dabei in einer wesentlich verkürzten Zeit für die Aufnahme eines Bildes (bis zu einem Faktor 104) aufgrund eines stark erhöhten Streuquerschnitts. Im Unterschied zu Raman und CARS betonen SHG und TPEF morphologische Details. Dabei ist SHG besonders sensitiv für geordnete, nicht zentrosymmetrische Strukturen wie z. B. Kollagen, wohingegen TPEF auf körpereigene fluoreszierende Stoffe wie NAD(P)H, Flavine, Elastine usw. anspricht. Abbildung 3 vergleicht TPEF-, CARS und Raman-Mikroskopie eines ungefärbten Hirntumordünnschnittes mit dem lichtmikroskopischen Bild des nachträglich Hämatoxylin und Eosin gefärbten Präparats. Insbesondere die Zellkerne, die mit allen Methoden aufgelöst werden, sind für eine histopathologische Bewertung von Interesse. Mit Hilfe der kombinierten morphologischen und funktionellen Information durch den multimodalen Ansatz bestehen gute Chancen, photonische Werkzeuge zu entwickeln, die zum einen in der Lage sind, Tumore früh zu entdecken und zu klassifizieren, und zum anderen erlauben die Tumorgrenzen z. B. während eines chirurgischen Eingriffs zur Entfernung des Tumors zu lokalisieren.

Diagnostik kardiovaskulärer Krankheiten
Im Mittelpunkt steht hier die zukünftige in-vivo-Anwendung der Raman-Spektroskopie zur endoskopischen Untersuchung von Plaques in Arterien. Zur Beurteilung, ob eine Ablagerung gefährlich ist, d. h. sich von der Gefäßwand lösen und Verstopfungen verursachen kann, ist eine Beurteilung der Morphologie nicht ausreichend. Da die Raman-Spektren von Kalziumphosphat, Bindegeweben, Triglyzeriden und Cholesterin gut unterscheidbar sind, erlaubt die endoskopische Raman-Spektroskopie prinzipiell die Bestimmung der Plaque-Zusammensetzung und damit der Gefährlichkeit der Ablagerungen. Erste Versuche an Kaninchen bestätigen den Wert dieses Ansatzes. Wie in Abbildung 4 dargestellt ist, wurde eine Sonde von 1 mm Durchmesser mit einer zentralen Anregungsfaser und 12 Detektionsfasern für ex-vivo-Messungen eingesetzt [5]. Die Raman-Spektren wurden mit dieser Raman-Sonde unter in-vivo-Bedingungen aufgenommen. Die Signale von Plaque-Ablagerungen unterscheiden sich in der Intensität und spektralen Beiträgen von Lipiden von den Signalen der Arterienwand mit Kollagenbanden und vom Blut mit Banden von roten Blutkörpern. Zukünftige Entwicklungen zielen auf eine Kombination von Raman mit optischer Kohärenztomographie und/oder Ultraschall ab, um die Molekül-spezifischen Informationen mit morphologischen zu kombinieren. Zudem wird eine Miniaturisierung angestrebt um auch Arterien mit kleineren Durchmessern untersuchen zu können.

 

Referenzen
[1] Harz M. et al.: Cytometry A 75A, 104-113 (2009)
[2] Schröder U.-Ch. et al.: Infection 41 (Suppl.1), P036 (2013)
[3] Dochow S. et al.: Anal Bioanal Chem. 405, 2743-2746 (2013)
[4] Meyer T. et al.: J. Biomed. Optics 16, 021113 (2011)
[5] Matthäus C. et al.: Anal. Chem. 84, 7845-7851 (2012)

Autor(en)

Kontaktieren

FSU Universität Jena
Helmholtzweg 4
07743 Jena
Deutschland
Telefon: 03641/9300
Telefax: 03641/931682

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.