Roboter im Protein-Hochdurchsatzscreening

Wie Roboter auf der Suche nach neuen Enzymen helfen

  • Abb. 1: Protein Hochdurchsatz-Screening Plattform der Universität Greifswald.Abb. 1: Protein Hochdurchsatz-Screening Plattform der Universität Greifswald.
  • Abb. 1: Protein Hochdurchsatz-Screening Plattform der Universität Greifswald.
  • Abb. 2: Iterativer Hochdurchsatz-Durchmusterungsprozess. (A) Planungs- und Optimierungsphase. (B) Initialisierung. (C) Der eigentliche Roboter-Prozess (s. Text). (D) Evaluierungs-, Visualisierungs- und Präsentationsphase.
  • Abb. 3: Beispiel für die automatische split-GFP basierte Evaluierung und Normierung. Codierung der Hintergrundfarbe: Kemp-Eliminase-Aktivität. Grüner Balken: Fluoreszenz (gebildete Proteinmenge der Kemp-Eliminase). Rote Linie: Gefittete Kemp-Aktivitätsmessung. Roter Punkt: Aktivität besser als die der Referenz.

Als Karel Čapek Roboter („roboti“) in seinem 1921 in Prag uraufgeführten Theaterstück Rossumovi Univerzální Roboti R.U.R [1] als humanoide Arbeiter charakterisierte, verband er deren Existenz mit modifizierten biochemischen Prozessen. Diese Ideen könnten von den in Prag kursierenden Erzählungen des Golems, einer von Menschen zur Arbeit aus den vier „Urelementen“ geformten Kreatur, inspiriert sein.

Modifizierte biochemische Prozesse sind zwar nicht die Materie, aus denen die Roboterplattform des Instituts für Biochemie der Universität Greifswald (Abb. 1) konstruiert ist, aber der Gegenstand ihrer Anwendung. Genauer wird sie zum Hochdurchsatzscreening von Proteinvarianten, insbesondere Enzymen, eingesetzt. Hierbei werden Prinzipien, die Charles Darwin in seinem Werk „On the origin of the species“ [2] formuliert hatte, im Labor genutzt: Eine Ausgangspopulation von Bakterien oder Hefezellen, die das eingefügte Gen eines Enzyms trägt, wird verschiedenen Mutationsprozessen unterworfen, z.B. fehlerbehaftete PCR oder ortsspezifische Sättigungsmutagenese, und anschließend auf eine Verbesserung der Enyzmeigenschaften durch Screening geprüft [3]. Die Roboter übernehmen dabei die zeitaufwendigen Routinearbeiten für die Biochemiker. Hierbei lässt die Anlage vollautomatisch die Zellen in einem kontrollierten Prozess im Mikrotiterplattenformat heranwachsen (Abb. 2), sorgt für den richtigen Expressionszeitpunkt der Fremdproteine, erntet die Zellen, schließt die Zellen auf (Zelllyse) und führt mit dem Rohextrakt Aktivitätstests durch (Abb. 2C), mit denen neue, nach einem vorher formulierten Kriterium als besser eingestufte Varianten gefunden werden sollen.

Die Resultate der Messungen werden in einer zentralen Datenbank gespeichert und von Evaluierungsroutinen statistisch analysiert und visualisiert. Die so gewonnenen Resultate können dann von den Wissenschaftlern über eine Webseite eingesehen und interpretiert werden (Abb. 2D).

Unterstützende Software
Dieses Vorgehen ermöglicht die vollautomatische Durchmusterung von 3.000-6.000 Varianten pro Woche. Im Gegensatz zu industriellen Roboteranlagen, bei denen ein bestimmter Prozess mehrere Monate oder gar Jahre unverändert abläuft, ist die Plattform in Greifswald so konzipiert, dass sehr flexibel auf neue Anwendungen und Forschungsfragestellungen reagiert werden kann.

Dies ermöglicht die LARA Software Suite (lara.uni-greifswald.de) die an unserem Institut speziell zur Erreichung dieser hohen Flexibilität entwickelt wurde.

LARA unterstützt den Anwender bei der Planung der Experimente, Programmierung der Roboter in einer an den biochemischen Prozess angelehnten Programmiersprache, der statistischen Evaluierung und der Visualisierung der erhaltenen Daten.

Derzeit werden in der Greifswalder Anlage insbesondere vier Enzymklassen untersucht: Transaminasen, Baeyer-Villiger-Monoxygenasen, Esterasen und auf Calmodulin-basierende de-novo-Enzyme, wie die Kemp-Eliminase. Im Vordergrund stehen hierbei die Veränderung der Substratspezifität oder Stereoselektivität, die Proteinstabilität gegenüber harschen Prozessbedingungen, wie höheren Temperaturen, Lösungsmitteln und natürlich auch die Grundlagenforschung an Mechanismen der Enzymaktivität.

Split-GFP-System
Als neues Werkzeug beschrieben wir jüngst die Übertragung der split-green-fluorescent-protein (split-GFP)-Methode, die ursprünglich zur Bestimmung der Löslichkeit von Protein entwickelt wurde [4], auf das Hochdurchsatzscreening [5]. Eine C- oder N-terminal am Zielenzym angefügte Aminosäuresequenz, bestehend aus 16 Aminosäuren (GFP11), komplementiert hierbei das um diese kurze Sequenz verkürzte GFP (GFP 1-10). Das GFP1-10 wird vor dem Screening separat hergestellt und aufgereinigt. Nur bei erfolgreicher Zusammenlagerung beider Komponenten ist ein Fluoreszenzsignal des reifen GFP messbar, welches direkt mit der Proteinkonzentration zusammenhängt. Dieses analytische Verfahren kann zur Reduzierung von falsch-positiven „Hits“ und der Detektion von falsch-negativen „Hits“ (verborgenen Hits) angewendet werden (Abb. 3). Bei konventionellen Screeningverfahren wird die starke Variation der Proteinexpression in Mutantenbibliotheken bislang nicht berücksichtigt. Dies führt dazu, dass eine durch natürliche Fluktuation besonders hoch exprimierte Variante als besonders aktiv gemessen wird, obwohl sie nur das Ausgangsenzym („Wildtyp“) darstellt. Weiterhin werden weniger lösliche aber dennoch aktivere Varianten beim konventionellen Screening oft übersehen, wenn ihre Aktivität nicht über die Wildtypaktivität hinausreicht.
Messung des Proteingehalts

Das split-GFP System ist so konzipiert, dass es die ursprüngliche Enzymaktivität (im Gegensatz zu z.B. Fusionsproteinen) nur sehr wenig beeinflusst und es kann überall dort eingesetzt werden, wo auch Affinitätstags (wie der His-tag) zur Proteinaufreinigung eingesetzt werden können (eine Kombination mit dem His-tag ist ebenfalls möglich). Dies ermöglicht eine hinreichend exakte Bestimmung des Proteingehalts des exprimierten Proteins im unaufgereinigten Zellrohextrakt und damit eine Normierung der Enzymaktivität auf die in der Probe wirklich vorhandenen Proteinmenge, da die restlichen zellulären Proteine nur ein geringes Hintergrundsignal erzeugen. Auch diese Bestimmung des Proteingehaltes durch die split-GFP Methode wird durch den Roboter in einem parallel zur Aktivitätsmessung ablaufenden Prozess automatisch durchgeführt, sodass es nur notwendig ist, dem System alle notwendigen Reagenzien und Behälter vorzuhalten.

Vor- und Nachteile von Robotern
Leider sind die eingesetzten Roboter, genau wie der mystische Golem, gefühllos oder gar blind, d.h. sie verrichten ihre Arbeit – genau wie es Kerstin Thurow und Hui Liu jüngst in GIT beschrieben haben [6] – ohne zu „merken, zu wissen oder zu sehen“, was sie da tun. Sie sind auf die genau vordefinierte Position der verwendeten Container und Analysegeräten um sie herum angewiesen. Falls sich diese Position leicht ändert, können schwere Kollisionen auftreten und das macht die Arbeiten wie Frau Thurow und ihre Kollegen sie leisten besonders wertvoll. Das ist auch der Grund, warum solche Systeme durch Sicherheitstüren oder Lichtschranken vor menschlichen Zugriffen geschützt sind.

Neben dem Gefühl fehlt auch, wie bei Čapeks „Roboti“ oder dem Golem, bei den an der Universität Greifswald eingesetzten Robotern die eigene Intelligenz. Sie verrichten aber ihre Arbeit Tag und Nacht und selbst am Wochenende mit guter Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Experimente. Optimierte und fehlerreduzierte Prozesse ermöglichen den beteiligten Wissenschaftlern eine Konzentration auf den kreativeren Teil der wissenschaftlichen Arbeit, wie das Design der Proteinbibliothek, die vergleichende Auswertung der Ergebnisse und die Konzeption neuer Iterationen. Im Bereich der Sensorik und der künstlichen Intelligenz ist noch viel Raum für Entwicklungen, um solche Systeme näher an den Menschen heranzubringen. Die Roboteranlage LARA wurde jedenfalls zu einem unersetzlichen Bestandteil unserer Forschung.

Danksagung
Wir danken der Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, INST 292/118-1 FUGG) und dem Bundesland Mecklenburg-Vorpommern für die Finanzierung der Plattform.

Autoren
Mark Dörr1, Dominique Böttcher1, Uwe T. Bornscheuer1

Zugehörigkeit
1Institut für Biochemie, Abteilung Biotechnologie & Enzymkatalyse, Universität Greifswald, Greifswald, Deutschland

Kontakt
Dr. Mark Dörr
Institut für Biochemie
Abteilung Biotechnologie & Enzymkatalyse
Universität Greifswald
Greifswald
mark.doerr@uni-greifswald.de

Literatur

[1] Karel Čapek, Rossumovi Univerzální Roboti R.U.R (Rossum’s Universal Robots), Prag, 1921

[2] Charles Darwin, On the Origin of Species by Means of Natural Selection, or the Preservation of Favoured Races in the Struggle for Life, John Murray, London, 1859

[3] Timo Davids, Marlen Schmidt, Dominique Böttcher, Uwe T. Bornscheuer, Strategies for the discovery and engineering of enzymes for Biocatalysis, Curr. Opin. Chem. Biol. 17, 215-220 (2013) – DOI: 10.1016./j.cbpa.2013.02.022

[4] Stéphanie Cabantous, Thomas C. Terwilliger, Geoffrey S. Waldo, Protein Tagging and Detection with Engineered Self-Assembling Fragments of Green Fluorescent Protein, Nat. Biotechnol. 23, 102–107 (2005) – DOI: 10.1038/nbt1044

[5] Javier Santos-Aberturas, Mark Dörr, Geoffrey S. Waldo, Uwe T. Bornscheuer, In-Depth High-Throughput Screening of Protein Engineering Libraries by Split-GFP Direct Crude Cell Extract Data Normalization, Chem. Biol. 22, 1406-14 (2015) – DOI: 10.1016/j.chembiol.2015.08.014

[6] Mark Dörr, Michael P. C. Fibinger, Daniel Last, Sandy Schmidt, Javier Santos-Aberturas, Clare Vickers, Moritz Voss, Uwe T. Bornscheuer, Fully automatized high-throughput enzyme library screening using a robotic platform, Biotechnol. Bioeng. 2015, revision submitted.

[7] Kerstin Thurow, Hui Liu, Automation im Life Sciences Bereich, GIT Labor-Fachzeitschrift 10, 26-29 (2015)

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.