Sandwich-ELISA

Der Klassiker unter den Immunoassays

  • Abb. 1: Schematische Darstellung eines Sandwich-ELISA.Abb. 1: Schematische Darstellung eines Sandwich-ELISA.

Der Sandwich-ELISA ist ein häufig genutzter Nachweistest, der für viele verschiedene Analyte nutzbar ist. Analyte, für die man spezifisch bindende Antikörper hat, bezeichnet man auch als deren Antigene. Für den Test werden zwei Antikörper benötigt, die beide spezifisch, aber an unterschiedlichen Stellen an das Antigen binden. Damit dies funktionieren kann, muss der Analyt eine entsprechende Größe aufweisen.

Als erster Schritt wird der Fängerantikörper auf der Oberfläche einer ELISA-Platte immobilisiert. Anschließend müssen die noch freien Bindungsstellen auf der Kunststoffoberfläche mit einer Blockierungslösung abgesättigt werden. Danach können die Proben bzw. die Kalibrationsstandards zugegeben werden. Dabei bindet das Antigen spezifisch an den Fängerantikörper. Im letzten Schritt wird dann ein Enzym-markierter Detektor-antikörper zugegeben, der wiederum das Antigen bindet. Dieser Komplex kann dann mit Hilfe einer Farbreaktion nachgewiesen und quantifiziert werden. Das grundlegende Prinzip ist schematisch in Abb.1 dargestellt.

Arbeitsschritte
Im Folgenden werden die einzelnen Arbeitsschritte genauer erläutert. Die angegebenen Volumina und Zeiten sind nicht bindend und können von Assay zu Assay variieren.

Um den Fängerantikörper auf der ELISA-Platte zu immobilisieren, gibt man 100-150 µL Antikörperlösung in jedes Well (in einer Konzentration von 0,1-10 µg/mL in einem PBS- oder Carbonat-basierenden Coating Puffer) und inkubiert bei Raumtemperatur 1-4 Stunden bzw. über Nacht bei 4°C. Wichtig dabei ist, dass die Platte gut abgedeckt ist, um Verdunstung zu reduzieren.

Anschließend wird die Plate 3-5x mit 200 - 300 µL Waschpuffer / Well gewaschen (z. B. PBS Tween Puffer). Empfehlenswert ist hierbei immer die Verwendung eines automatischen Waschgeräts, damit die Waschschritte einheitlich durchgeführt werden können.

Da auch viele andere Proteine oder Moleküle aus der Probe an die Oberfläche der ELISA-Platte binden würden, muss diese mit einer geeigneten Blockierungslösung blockiert werden. Hierfür werden je nach Anwendung Blockierer auf Casein-Basis, BSA-Basis oder auch synthetische Blocker genutzt.

Wichtig ist, dass die Oberfläche mit einer möglichst lückenlosen Schicht von Molekülen belegt ist. Daher ist es sinnvoll, wenn Blockierer auch kleine Proteinfragmente oder Peptide enthalten, da diese sich besonders gut auf Kunststoff anlagern. Dafür werden 200 µL Blockierer pro Well pipettiert und dann 1 - 2 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wird die Platte wieder 3-5x mit Waschpuffer gewaschen.

Optional kann man danach die Platte mit einem Stabilisierer beschichten, um sie anschließend in getrocknetem Zustand für längere Zeit lagern zu können. Hierzu gibt man 200 µL eines Coating Stabilisierers pro Well hinzu und inkubiert 15 - 90 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wird die Lösung abgesaugt und die Platte 1-2 Stunden bei 37-45°C getrocknet. Danach kann sie in Folie eingeschweißt und für 1-3 Jahre bei 2-8°C gelagert werden. So werden auch ELISA-Platten für kommerziell erhältliche Kits stabilisiert. Die Haltbarkeit ist abhängig vom verwendeten Antikörper und sollte daher entsprechend getestet werden.

Danach erfolgt die Zugabe der in Assaypuffer verdünnten Proben bzw. der Standards. Wenn möglich, sollten die Standards in derselben Matrix gemessen werden wie die Probe selbst. Wenn die Matrix, z. B. Blutserum, nicht ohne Analyt verfügbar ist (Nullserum), behilft man sich mit einer Surrogatmatrix mit ähnlichen Eigenschaften. Zur Inkubation pipettiert man 100 -150 µL in jedes Well und inkubiert 30 Minuten bei Raumtemperatur. Es sollte dabei immer eine Doppelbestimmung der Proben erfolgen. Sofern Realproben, wie z. B. Blutseren, gemessen werden, sollte man einen modernen Assaypuffer verwenden, der Interferenzen wie Kreuzreaktivitäten und Matrixeffekte reduzieren kann, damit man Fehlbestimmungen wie Falsch-Positive vermeiden kann und niedrige Variationskoeffizienten erhält. Früher übliche Puffer wie PBS/BSA/Tween sind für zuverlässige ELISA ungeeignet. Anschließend wird wieder 3-5x mit Waschpuffer gewaschen.

Detektion
Dann kann der markierte Detektorantikörper (z.B. mit Meerrettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase markiert) zugegeben werden. Als Faustregel gilt hierbei, dass die Konzentration ca. 10 -100-fach oberhalb der höchsten zu erwartenden Analytkonzentration in der Realprobe liegen sollte oder alternativ in 10-100-fachem Überschuss zum höchsten Standard in der Kalibrationskurve. Es werden 100 - 150 µL Detektorantikörper in Assaypuffer pro Well zugegeben und 2 - 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.

Wegen der langsamen Inaktivierung des Enzyms kann man den Detektorantikörper nicht lange in Assaypuffer lagern. Hierfür gibt es spezielle HRP oder AP Stabilisierer, die jedoch gleichzeitig auch gute Assaypuffer sein müssen. Darin kann man die Detektorantikörper über Monate lagern, ohne dass es zu einem im Assay relevanten Abbau der Enzymaktivität oder Bindung kommt. Anschließend wird wieder 3-5x mit Waschpuffer gewaschen.

Als letzter Schritt kann jetzt die Detektion erfolgen. Dies kann im Fall eines Peroxidase-makieten Sekundärantikörpers mit TMB erfolgen. Dafür pipettiert man 100-150 µL TMB-Lösung in jedes Well und inkubiert 10-20 Minuten. Danach wird die Reaktion mit 50 µL 2N H2SO4 gestoppt und kann im ELISA Reader bei 450 nm vermessen werden. Je stärker der Farbumschlag ist, desto mehr Analyt ist in der Probe vorhanden. Die quantitative Auswertung erfolgt mit Hilfe der Kalibrationskurve.

Kontakt
Dr. Sabine Glöggler
Candor Bioscience GmbH
Wangen, Deutschland
s.gloeggler@candor-bioscience.de
www.candor-bioscience.de

Online Version: http://www.git-labor.de/

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Simoniusstr. 39
88239 Wangen
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Telefon: +49 7522 79527 11

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