Selektivitätsgewinn bei der Analytik biologischer Proben

Gekoppelte Differentielle Ionenmobilitäts- und Massenspektrometrie

  • Abb. 1: Schematische Darstellung des DMS-IonenfiltersAbb. 1: Schematische Darstellung des DMS-Ionenfilters
  • Abb. 1: Schematische Darstellung des DMS-Ionenfilters
  • Abb. 2: Asymetrisches elektrisches Feld E(t) in der Driftzelle und feldabhängige dynamische Clustering/Declustering-Vorgänge während der DMS-Trennung
  • Abb. 3: Differentielles Mobilitätsspektrum. Einfluß von CV, ΔK und α
  • Abb. 4: ESI-DMS-MS/MS-Trennung verschiedener Wirkstoffmoleküle ohne (oben) und mit Modifier (Isopropanol, unten). Die individuellen Ionenspuren sind auf 100 % angeglichen. Instrument: AB Sciex API 5500 QTRAP mit SelexIon-DMS.
  • Abb. 5: ESI-DMS-MS/MS-Trennung von sieben unterschiedlichen Isomeren und Isobaren mit m/-z 401. Alle Ionenspuren wurden auf 100 % angeglichen. Modifier: Isopropanol. Instrument: AB Sciex API 5500 QTRAP mit SelexIon-DMS.
  • Prof. Dr. Dietrich A. Volmer

Die Differenzielle Ionenmobilitäts-Spektrometrie (DMS) ist eine Gasphasentrenntechnik, dessen Trennmechanismus auf den unterschiedlichen Mobilitäten von Ionen in einem elektrischen Wechselfeld beruht. Die DMS ist seit vielen Jahren als Analysator für gasförmige Proben im Einsatz, gewinnt aber in jüngster Zeit zunehmend als Eingangsstufe für die Massenspektrometrie an Bedeutung.

Die gekoppelte LC-DMS-MS steigert die Selektivität, trennt isobare und isomere Komponenten, entfernt co-eluierende Matrixstörungen und verbessert das Signal-Rauschverhältnis bei der Messung komplexer biologischer Proben.

Trennprinzip der DMS
Die klassische Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) trennt bei Atmosphärendruck erzeugte Ionen in einer Driftzelle unter Verwendung eines elektrischen Feldes. Die Geschwindigkeit (und die Ankunftszeit am Detektor) der Ionen, die gegen einen Gasstrom wandern, hängt dabei u. a. von Masse, Ladung und Struktur der Ionen ab [1]; diese ist proportional zur Feldstärke E: vd = KE. K ist der substanzspezifische Ionenmobilitätskoeffizient, der mit dem Kollisionsquerschnitt zusammenhängt.

Die Differentielle Ionenmobilitätsspektrometrie (DMS) nutzt die Feldabhängigkeit von K für die Trennung aus. Das Kernstück des DMS-Analysators besteht aus zwei parallelen Elektroden, an die eine asymmetrische Wechselspannung senkrecht zum Transportgasfluss angelegt wird („separation voltage", SV, Abb. 1). Bei der sehr ähnlichen „Field asymetric ion mobility spectrometry", FAIMS, ist der Driftraum von zylindrischen Elektroden umgeben [2]. Die Wechselspannung erzeugt ein elektrisches Wechselfeld, welches zwischen einer schwachen und starken Komponente alterniert. Dieses Feld ermöglicht die Migration der Ionen durch das Transportgas (Stickstoff, Luft). Die Driftgeschwindigkeit ist proportional zum Verhältnis aus elektrischem Feld und der Transportgasdichte. Physikochemische Eigenschaften, die die Beweglichkeit im Transportgas beeinflussen, sind u. a. Konformation, Ladungsverteilung und Polarisierbarkeit des Ions [3].

Im schwachen Feld nimmt das Ion zwar Energie auf, diese ist aber deutlich geringer als die durch Kollisionen mit dem Transportgas zugeführte thermische Energie.

Daher weisen Ionen und Transportgas sehr ähnliche Energien auf und Diffusionsprozesse dominieren die Ionenbewegung. K ist in dieser Phase nicht vom Feld abhängig. Das ändert sich jedoch, wenn das starke Feld einwirkt. Die Feldabhängigkeit wird durch die α-Funktion beschrieben, welche die relative Änderung der Ionenmobilität beim Übergang vom schwachen zum starken Feld beschreibt: α = (Kh-Kl)/ Kl = ΔK/Kl.

Die Bewegung von Ionen im Feld
Kh ist die Mobilität im starken, Kl die im schwachen Feld. ΔK und α haben positive Zahlenwerte, wenn die Mobilität im starken größer als im schwachen Feld ist. Ist umgekehrt die Mobilität im schwachen Feld größer, sind ΔK und α negativ. In diesem Zusammenhang ist die asymmetrische Wellenform des Feldes (Periode T = th + tl) wichtig (Abb. 2). Die Feldstärke im Verlauf der positiven Halbperiode th ist so gewählt, dass sie deutlich größer als während der negativen Halbperiode tl (für tl « th) ist [4], das zeitliche Integral sich aber über die asymmetrische Gesamtperiode aufhebt. Daraus resultiert eine Oszillation mit der Periode T in transversaler Richtung im Transportgas. Wären Kh und Kl gleich groß, so würden sich die Ionen nicht in Richtung der Elektroden bewegen, sondern während des Drifts im Zentrum der Strecke bleiben. Sind sie unterschiedlich, ergibt sich eine effektive Nettoauslenkung der oszillierenden Wellenform. Die Ionen driften während des starken Feldes für eine kurze Zeit senkrecht zum Gasstrom in Richtung der oberen Elektrode; unter Einwirkung des schwachen Feldes für eine längere Zeit in die entgegengesetzte Richtung. Die Driftgeschwindigkeit im schwachen Feld entspricht der klassischen IMS (s.o.).

Wichtig ist, dass ein Ion nur dann am Detektor ankommt, wenn seine transversale Driftgeschwindigkeit null beträgt (α = 0). Ansonsten würde es sich vorher an einer der beiden Elektroden entladen (Abb. 1). Um diese transversale Driftgeschwindigkeit eines Ions zu eliminieren, legt man eine zusätzliche, kompensierende Gleichspannung an, die „compensation voltage" (CV), die das Ion quasi ins Zentrum „zurückzieht". Aufgrund der substanzspezifischen Driftgeschwindigkeiten werden natürlich substanzspezifische Kompensationsspannungen benötigt, um die Driftstrecke unbeschadet zu überstehen. Ein Ion mit α > 0 (= größere Mobilität im starken Feld) migriert in Richtung der oberen Elektrode; um diese transversale Bewegung zu kompensieren wird eine negative CV benötigt. Umgekehrt migriert ein Ion mit α < 0 (= größere Mobilität im schwachen Feld) in Richtung der unteren Elektrode und benötigt eine positive Spannung, um den Driftweg zurück ins Zentrum zu korrigieren. Die für ein bestimmtes Ion benötigte Kompensationsspannung hängt neben Struktur und Ladung von weiteren Parametern ab, z. B. Temperatur, Druck und Gasflussrate. Genau wie die Retentionszeit der Chromatographie, kann die Kompensationsspannung zur Charakterisierung der Substanz verwendet werden.

Differentielle Ionenmobilitätsspektren
Eine schrittweise Erhöhung der Spannung lässt alle Ionen der Reihe nach die Driftstrecke passieren. Dieser Scan ergibt das sog. Differentielle Ionenmobilitätsspektrum (Abb. 3).

Es wird deutlich, dass die DMS eigentlich ein einstellbarer Filter ist, der Ionen aufgrund bestimmter physikochemischer Eigenschaften in der Driftzelle selektiert. Die DMS ähnelt daher dem Quadrupol-MS, wohingegen die IMS mit dem „time-of-flight" (TOF)-MS vergleichbar ist.
Die DMS-Trennung kann durch chemische Modifier beeinflusst werden [5]. Insbesondere verbessern dem Transportgas zugemischte polare Modifier sehr häufig die Effizienz, was durch Clusterbildung erklärbar ist (= Dynamisches Clustering/Declustering-Modell [6]). Die Bildung von Ionen/Molekül-Clustern tritt während des schwachen elektrischen Feldes auf; dadurch erhöht sich die Größe und der Kollisionsquerschnitt des ionischen Komplexes und die Mobilität verringert sich (Abb. 2). Bei Einwirkung des starken elektrischen Feldes kommt es dann wieder zu einer Dissoziation der Ionen/Molekül-Cluster und zur Verkleinerung des Kollisionsquerschnitts (bzw. Erhöhung der Mobilität). Dieser Zyklus wiederholt sich im Rhythmus der hochfrequenten Wechselspannung, die einige Megahertz beträgt. Obwohl ein Ion eigentlich nur wenige Millisekunden benötigt um die Zelle zu durchqueren, durchläuft es in dieser Zeitspanne trotzdem einige tausende Clustering/Declustering-Vogänge.

Trennleistung
Geeignete Kennzahlen zur Beschreibung der DMS-Effizienz werden analog zur Chromatographie definiert, z. B. die Peak-Kapazität. Man ersetzt lediglich chromatographische Peak-Breite und Gesamtelutionszeit aller zu trennenden Substanzen durch DMS-Peak-Breite und Kompensationsspannungsbereich, in dem alle zu trennenden Substanzen die DMS-Zelle passieren. Die Trennschärfe zweier benachbarter Peaks kann ebenfalls, wie aus der Chromatographie bekannt, über die Auflösung beschrieben werden.

Kopplung DMS-MS
Da die DMS bei Atmosphärendruck arbeitet, lässt sie sich sehr einfach einsetzen und kombinieren, als eigenständiges Analysesystem oder in Verbindung mit anderen Trenntechniken (z. B. GC-DMS).

Die orthogonale Kopplung mit der Massenspektrometrie ist besonders interessant (Abb. 1). In der Entwicklung der DMS-MS-Kopplung haben zunächst zahlreiche Elektrospray-FAIMS-MS-Methoden das Potential der Technik gezeigt, z. B. für die Peptidanalytik.
Eine neue kommerzielle Variante der DMS (AB Sciex Selexion) erlaubt den Zusatz polarer chemischer Modifier zur DMS-Gasphase, was das Einsatzpotential in der Analytik biologischer Proben deutlich erhöht, da sich bei dieser Variante die oben erwähnten Clustering/Declustering-Phänomene direkt beeinflussen lassen.

Anwendungen der DMS
Konzeptionell ergeben sich für den Einsatz der (LC)-DMS-MS-Kopplung unterschiedliche Einsatzmöglichkeiten:

  • Mischungen verschiedener Substanzen
  • Trennung von Isobaren und Isomeren
  • Beseitigung von Interferenzen bei der Bestimmung einer Zielsubstanz mit nachfolgender Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnis

Im ersten Fall „konkurriert" die DMS mit der HPLC. In der Tat gibt es eine gewisse Ähnlichkeit zwischen beiden Techniken. Beide setzen unterschiedliche physikochemische Eigenschaften der Analyten und chemische Wechselwirkungen als Basis für die Trennung voraus, obwohl sich die eigentlichen Trennmechanismen natürlich unterscheiden und die Peak-Kapazität der DMS geringer ist als die der HPLC. Die DMS hat allerdings deutliche Geschwindigkeitsvorteile. Abbildung 4 zeigt die DMS-Analyse pharmazeutischer Wirkstoffe nach Elektrospray-Ionisierung, ohne vorherige HPLC-Trennung. In diesem Beispiel ist der Einfluss des Modifiers Isopropanol deutlich erkennbar, der die Basislinientrennung aller Substanzen ermöglicht. Besonders sinnvoll ist diese Art der DMS-Implementierung, wenn keine vorherige HPLC-Trennung möglich ist und alle Substanzen immer zusammen analysiert werden müssen, wie z. B. bei der ortsaufgelösten Oberflächenanalyse oder der bildgebenden Massenspektrometrie. In der Literatur finden sich anschauliche Beispiele für die Extraktion von Pharmawirkstoffen und Metaboliten aus Gewebeschnitten mittels „liquid extraction surface analysis" (LESA)-Elektrospray-DMS-MS [7].

Ein wichtiges Anwendungsfeld ist die Trennung isomerer und isobarer Verbindungen, da die DMS besonders empfindlich auf regionale Unterschiede von Isomeren und Isobaren reagiert [3]. Dies hängt damit zusammen, dass die feldabhängigen Drifteigenschaften der Ionen im Unterschied zur MS kaum vom m/z-Verhältnis beeinflusst werden, sondern weitere physikochemische Eigenschaften bestimmend sind. Ein eindrucksvolles Beispiel zeigt Abbildung 5. Darin ist eine Probe in sieben isobare und isomere Substanzen verschiedenster Strukturen (alle m/z 401) aufgetrennt worden.

Die LC-DMS-MS-Kopplung kann auch zur Reduzierung des chemischen Rauschens der Elektrospray-Ionisierung oder zur Umgehung von Interferenzen in biologischen Proben eingesetzt werden. So verringert sich das chemische Rauschsignal, wenn eine DMS-Kompensationsspannung gewählt wird, die nur die Zielsubstanz durchlässt. In ähnlicher Weise können isobare endogene Interferenzen in komplexen biologischen Proben umgangen werden, wenn ihre DMS-Eigenschaften sich von der Zielsubstanz unterscheiden und sich Störsubstanzen effektiv herausfiltern lassen. Diese Vorgehensweise verbessert das Signal/Rausch-Verhältnis und vermeidet systematische Fehler.

Fazit
Die DMS-MS-Kopplung erweitert den Anwendungsbereich der LC-MS für die Bioanalytik und stellt deutliche Selektivitätsgewinne bereit, ohne das hochauflösende Massenspektrometer eingesetzt werden müssen. Die Orthogonalität der Methode als Vorstufe zur Massenspektrometrie ist im Vergleich zur klassischen Ionenmobilitätsspektrometrie deutlich stärker ausgeprägt, da zusätzliche, kaum von der Masse abhängige, Substanzeigenschaften das Mobilitätsverhalten beeinflussen. Da die DMS Substanzen nach der Ionisierung der Analyten trennt, lassen sich die in der LC-MS-Analytik biologischer Proben üblichen Ionenunterdrückungseffekte natürlich nicht umgehen.

Literatur
[1] Kanu A. B. et al.: J. Mass Spectrom. 43, 1-22 (2008)
[2] Purves R. W. et al.: Rev. Sci. Instrum. 69, 4094-4105 (1998)
[3] Coy S. L. et al.: Int. J. Mass Spectrom. 291, 108-117 (2010)
[4] Buryakov I. A. et al.: Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 128, 143-148 (1993)
[5] Schneider B. B. et al.: Int. J. Ion Mobil. Spec.15, 141-150 (2012)
[6] Schneider B. B. et al.: Anal. Chem. 82, 1867-1880 (2010)
[7] Parsons W. B. et al.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 3382-3386 (2011)

 

Autor(en)

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