Spektroskopie: Einflüsse von Biomolekülen auf das Wasser ihrer Hydrathülle

  • Abb. 1: Infrarot-Schwingungsspektrum von reinem Wasser mit Zuordnung der jeweiligen Schwingungsmoden (1 THz ≈ 33 cm-1)Abb. 1: Infrarot-Schwingungsspektrum von reinem Wasser mit Zuordnung der jeweiligen Schwingungsmoden (1 THz ≈ 33 cm-1)
  • Abb. 1: Infrarot-Schwingungsspektrum von reinem Wasser mit Zuordnung der jeweiligen Schwingungsmoden (1 THz ≈ 33 cm-1)
  • Abb. 2: Schematische Darstellung der konzentrationsabhängigen THz-Absorption einer wässrigen Lösung THz-transparenter Biomoleküle. Die blaue Gerade beschreibt die lineare Abnahme der Absorption im idealen Fall bzw. bei keiner signifikanten Beeinflussung der Wasserabsorption in der Hydrathülle der gelösten Moleküle. Die rote Kurve beschreibt den typischen Verlauf im Fall einer ausgedehnten Hydrathülle mit relativ zu reinem Wasser erhöhter THz-Absorption.
  • Abb. 3: Korrelation der Schwingungsbewegungen zwischen Atomen der Proteinoberfläche und Wassermolekülen der Hydrathülle als Funktion des Abstands d von der Proteinoberfläche (alt. x−Achse), bzw. des inversen Abstands k=2π/d, und der Schwingungsfrequenz aus einer Molekular- Dynamik-Simulation [7]. Gezeigt sind speziell die Korrelationen von Schwingungsbewegungen senkrecht zur Oberfläche des Proteins. Negative bzw. positive Werte beschreiben eine entgegengesetzte bzw. gleichgerichtete Schwingungsbewegung der jeweiligen Atome. In der linken und rechten Hälfte sind jeweils die Ergebnisse für hydrophile und hydrophobe Bereiche der Proteinoberfläche gezeigt. Beachtenswert ist, neben den offensichtlichen Unterschieden in beiden Hälften der Grafik, die von Null verschiedenen Korrelationen der Schwingungsbewegungen der Atome der Proteinoberfläche und von Wassermolekülen im Abstand von 10 Å bei Frequenzen unterhalb von 3 THz bzw. 100 cm-1.

THz-Spektroskopie: Wasser ist essentieller Bestandteil des Lebens. Der Wasseranteil menschlichen Gewebes beträgt bis zu 70 % und die darin stattfindenden biochemischen Prozesse sind optimal an diese wässrige Umgebung angepasst. Allerdings handelt es sich beim Cytosol oder der extrazellulären Matrix nicht um eine typische wässrige Lösung wie sie, z. B., in einem in vitro Experiment bei starker Verdünnung vorliegt. Stattdessen sind die Konzentrationen von Biomolekülen in biologisch relevanten Szenarios trotz des hohen Wasseranteils so groß, dass die gelösten Moleküle nur von wenigen Wassermolekülen getrennt werden.

Durch diese hohen Konzentrationen sind Wechselwirkungen zwischen gelösten Biomolekülen, Proteinen, Nukleinsäuren etc., nicht vernachlässigbar und führen unter anderem zum Effekt des ‚Molecular Crowding'.

Darüber hinaus verändern solvatisierte Moleküle auch die mikroskopischen Eigenschaften des umgebenden Lösungsmittels, wie sich makroskopisch beispielsweise anhand von Gefrierpunktserniedrigungen konzentrierter Salz- oder Zuckerlösungen beobachten lässt. Insbesondere wenn die Hydrathülle, Wassermoleküle in der Umgebung eines gelösten (hydratisierten) Biomoleküls mit von reinem Wasser unterscheidbaren Eigenschaften, über direkt an die Oberfläche des gelösten Moleküls gebundene Wassermoleküle hinausgeht, hätte dies zur Folge, dass die Eigenschaften des Wassers im Inneren einer Zelle signifikant von denen der reinen Flüssigkeit abweichen.

Wie groß ist die Hydrathülle eines Biomoleküls?
Experimentelle Beobachtungen mittels Kernspin-Relaxation, Neutronen- und Röntgenstreuung, femto-Sekunden aufgelöste Fluoreszenz und anderer Techniken können langreichweitige (> 5 Å) Einflüsse gelöster Moleküle auf die Struktur und Dynamik des Wassers in ihrer Hydrathülle nicht nachweisen [1 - 3].

Dieses Bild wird jedoch durch eine Serie von Messungen der konzentrationsabhängigen Terahertz-(THz)-Absorption von Proteinlösungen in Frage gestellt [4]. Bei Frequenzen von ca. 2,4 THz, bzw. in Wellenzahlen 80 cm-1, wird die Absorption von Schwingungsbewegungen im Wasserstoff-(H)-Brückennetzwerk des Wassers beobachtet.

Hierbei handelt es sich im Gegensatz zur klassischen Infrarot-Spektroskopie im nah-infraroten Frequenzbereich nicht um Schwingungsmoden der kovalenten Bindungen innerhalb eines Moleküls (intramolekular), wie zum Beispiel der O-H Streckschwingung des Wassers (3000 bis 3700 cm-1, s. Abb. 1). Stattdessen werden über die Absorption im THz- bzw. fern-infraroten Bereich des Spektrums Schwingungsbewegungen der im Vergleich schwachen intermolekularen H-Brückenbindungen zwischen Wassermolekülen beobachtet.

Sein ausgeprägtes Netzwerk aus H-Brückenbindungen verleiht Wasser seine einzigartigen Eigenschaften unter den molekularen Flüssigkeiten. Hierzu zählt der hohe Schmelzpunkt für ein Molekül dieser Größe, die Stabilität der flüssigen Phase über einen weiten Temperaturbereich, das Dichtemaximum bei 4 °C, sowie auch die Erzeugung hydrophober Effekte, welche in einer indirekten attraktiven Wechselwirkung zwischen Molekülen resultieren, die keine energetisch günstigen Interaktionen mit dem H-Brückennetzwerk des Wassers eingehen können.

Aufgrund der Bedeutung des H-Brückennetzwerks für die Eigenschaften des Wassers, ist die spezifische Detektion intermolekularer Schwingungen desselben im THz-Frequenzbereich zur Untersuchung potentieller Einflüsse auf mikroskopische Eigenschaften des Wassers besonders geeignet. Zur genauen Bestimmung der Absorption in Transmissionsmessungen werden besonders intensive Strahlungsquellen benötigt, wie zum Beispiel ein speziell für diesen Spektralbereich an der Ruhr-Universität Bochum eingesetzter p-Germanium Laser [5]. Im Experiment werden Änderungen der Wasserabsorption in Abhängigkeit von der Konzentration gelöster Biomoleküle, beispielsweise eines Proteins, verfolgt [4]. In der Praxis werden diese Messungen für Proteine bei Konzentrationen bis zu 1 % v/v durchgeführt um den Einfluss direkter Protein-Protein-Interaktionen zu verringern (spezifische Interaktionen bzw. die Bildung von Dimeren und Oligomeren werden zuvor durch die Wahl des Proteins ausgeschlossen). Die im Vergleich zum Wasser geringe Absorption der Biomoleküle selbst führt idealerweise zu einer linearen Abnahme der THz-Absorption bei steigender Konzentration der gelösten Moleküle. Eine häufig beobachtete Abweichung von diesem linearen Verhalten ermöglicht es, Informationen über den Einfluss der gelösten Moleküle auf die Absorptionseigenschaften des Wassers in ihrer Hydrathülle zu erhalten [4]. Eine nichtlineare Absorptionsänderung kann hierbei in erster Näherung durch den Überlapp individueller Hydrathüllen beschrieben werden, wie schematisch in Abbildung 2 gezeigt ist. Für mehrere globuläre Proteine weist der Konzentrationsverlauf der Absorption auf eine langreichweitige (~10 Å) Beeinflussung der H-Brücken-Schwingungen in der Hydrathülle der gelösten Proteine hin [4].

Kollektive Schwingungen des H-Brückennetzwerks
Die Diskrepanz dieses Ergebnisses und der Beobachtung eines lediglich kurzreichweitigen Einflusses (ca. 3-5 Å) auf die Struktur und Dynamik von Wassermolekülen in der Hydrathülle solvatisierter Biomoleküle mit anderen experimentellen Techniken, kann anhand von detaillierten Molekular-Dynamik-Simulationen aufgeklärt werden [6,7]. Diese zeigen, dass es sich bei den Schwingungen des H-Brückennetzwerks im Wasser, insbesondere im untersuchten THz-Frequenzbereich, um delokalisierte, kollektive Schwingungsbewegungen von räumlich durch bis zu 10 Å, bzw. mehrere H-Brücken, getrennte Moleküle handelt. Eine detaillierte Analyse der korrelierten Schwingungsbewegungen und Frequenzen bei steigendem Abstand zwischen beteiligten Molekülen, weist hierbei die für sich ausbreitende Schallwellen typische Dispersion auf, welche durch die Schwingungen des H-Brückennetzwerks in diesem Frequenzbereich übertragen werden [7]. Hierdurch erklärt sich die langreichweitige Beeinflussung der Schwingungen des H-Brückennetzwerks in der Hydrathülle gelöster Biomoleküle, da sich in diesem Frequenzbereich die veränderten Schwingungen von Wassermolekülen in direktem Kontakt mit der Proteinoberfläche sehr weit ausbreiten. Die detaillierte Analyse der korrelierten Schwingungen in der Hydrathülle eines Proteins in Molekular-Dynamik-Simulationen zeigt außerdem, dass die sich ausbreitenden Schwingungsbewegungen direkt von den Eigenschaften der solvatisierten Proteinoberfläche beeinflusst werden (s. Abb. 3).

Frequenzabhängige Definition der Hydrathülle
Mit steigender Frequenz nimmt die räumliche Delokalisierung der Schwingungs-bewegungen im H-Brückennetzwerk des Wassers ab, sodass bereits die Librations-bewegungen der Wassermoleküle, bei Frequenzen von etwa 20 THz bzw. 600 cm-1 (s. Abb 1), als lokalisierte Bewegungen betrachtet werden können. Daher ist es sinnvoll, den messbaren Einfluss eines gelösten Moleküls auf die Eigenschaften des Wassers, was uns in diesem Falle als Definition der Hydrathülle dient, als frequenzabhängige Größe zu behandeln. Hochfrequente Schwingungen sind hochempfindlich für lokale Änderungen der Umgebung, beispielsweise direkt an der Oberfläche eines gelösten Moleküls, während niederfrequente intermolekulare Schwingungsbewegungen (1-6 THz bzw. 30-200 cm-1) aufgrund ihrer delokalisierten Natur über große Abstände hinweg beeinflusst sind.

Simulationen können weiterhin zeigen, dass sich langreichweitige Effekte nicht durch Analyse der Schwingungsbewegungen einzelner Wassermoleküle detektieren lassen. Während sich das Schwingungsspektrum eines Wassermoleküls in direktem Kontakt mit dem gelösten Molekül durch die Wechselwirkungen mit diesem deutlich von reinem Wasser unterscheidet, liegen diese Unterschiede für etwas weiter entfernte Wassermoleküle unterhalb der Nachweisgrenze [7]. Langreichweitige Änderungen treten lediglich in der zeitaufgelösten Korrelation zwischen Schwingungsbewegungen auf der Proteinoberfläche und der Hydrathüllen-Wassermoleküle auf, welche eine Phasenabhängigkeit der Schwingungen beschreiben. Die experimentell beobachtete langreichweitige Beeinflussung der Wasser THz-Absorption, welche theoretisch durch Fluktuationen des Gesamtdipolmoments beschrieben wird, kann daher auf eine ‚Synchronisation' der Schwingungsbewegungen des Proteins und der Wassermoleküle in der Hydrathülle zurückgeführt werden. Wie Abbildung 3 zeigt, hängt dieser Effekt von den chemischen Eigenschaften der exponierten Proteinoberfläche ab und ist daher innerhalb der Hydrathülle nicht homogen. Darüber, ob und in wieweit eine langreichweitige Beeinflussung des umgebenden Wassers durch Proteine, insbesondere in der hochkonzentrierten Umgebung einer lebenden Zelle, Einfluss auf die Rolle des Wassers in biologischen Prozessen hat, kann man zu diesem Zeitpunkt nur spekulieren. Neuere experimentelle Ergebnisse, die eine Änderung der Wasser-THz-Absorption im Verlauf enzymatisch katalysierter Reaktionen sowie während der Proteinfaltung beobachten, als auch die Tatsache das Proteine im Laufe der Evolution speziell an ihre wässrige Umgebung angepasst wurden, legen einen solchen Schluss jedoch nahe [8,9].

Zusammenfassung
Die intermolekularen Schwingungen des H-Brückennetzwerks von Wasser bei Frequenzen von 1-6 THz bzw. 30-200 cm-1 sind delokalisiert und Korrelationen der Schwingungsbewegungen können in Simulationen über Abstände von bis zu 10 Å nachgewiesen werden. Lokale Störungen der Wasserstruktur bzw. der Wechselwirkungen mit Nachbarmolekülen, zum Beispiel durch gelöste Moleküle, führen daher zu einer langreichweitigen Änderung der Absorptionseigenschaften des Wassers im THz-Spektrum. Aufgrund der hohen Konzentrationen von Proteinen, Nukleinsäuren und anderen Biomolekülen in biologisch relevanten Systemen, zum Beispiel dem Inneren einer Zelle, werden daher die intermolekularen Schwingungen des gesamten intrazellulären Wassers durch Biomoleküle beeinflusst ist.

Danksagung
Der Autor dankt dem von der Deutschen Forschungsgemeinschaft geförderten Exzellenzcluster RESOLV (EXC 1069) für die Zusammenarbeit und finanzielle Unterstützung. Darüber hinaus gilt Dank Prof. Douglas J. Tobias von der University of California, Irvine, und dem Lehrstuhl für Physikalische Chemie II von Prof. Dr. Martina Havenith-Newen an der Ruhr-Universität Bochum für die langjährige Zusammenarbeit.

Literatur
[1] Qvist J. et al.: Faraday Discuss 141, 131 (2009)
[2] Svergun D. I. et al.: Proc Natl Acad Sci U S A 95 (5), 2267 (1998)
[3] Pal S. K. et al.: J Phys Chem B 106 (48), 12376 (2002)
[4] Ebbinghaus S. et al.: P Natl Acad Sci USA 104 (52), 20749 (2007); Born B. et al.: Faraday Discuss 141, 161 (2009)
[5] Bergner A. et al.: Rev Sci Instrum 76 (6) (2005)
[6] Heyden M. et al.: P Natl Acad Sci USA 107 (27), 12068 (2010); Heyden M.: J Phys Chem Lett 3 (16), 2135 (2012)
[7] Heyden M. and Tobias D. J., Phys Rev Lett 111 (21) (2013)
[8] Grossman M. et al.: Abstr Pap Am Chem S 243 (2012)
[9] Kim,S. J. et al.: Angew Chem Int Edit 47 (34), 6486 (2008)
[10] Bertie J. E. and Lan Z. D.: Appl Spectrosc 50 (8), 1047 (1996)

 

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