Steht die Ampel auf Grün?

Der Weg der Mikro-LC in die Routineanalytik

  • U.S. Army photo by Spc. John CrosbyU.S. Army photo by Spc. John Crosby
  • U.S. Army photo by Spc. John Crosby
  • Tab. 1: Angabe wichtiger Kenngrößen zur Bestimmung der Trenneffizienz kommerziell verfügbarer Mikro-LC Säulen. Stationäre Phasen: siehe Abbildung 1.
  • Abb. 1: Van-Deemter Kurve für Naphthalin in Abhängigkeit des Partikeldurchmessers der stationären Phase (YMC Triart C18, 50 x 0,3 mm, ❍ 1,9 µm, ■ 3,0 µm) bei einer Temperatur von 30 °C.
  • Abb. 2: Schematische Darstellung eines Multidetektionsverfahrens bestehend aus einer flexibel positionierbaren UV-Zelle und einem Massenspektrometer.
  • Abb. 3: Methode zur Trennung von 15 polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen. Stationäre Phase: YMC-PAH, 50 x 0,3 mm, 3,0 µm, Flussrate: 20 µL min-1, Temperatur: 26 °C, Injektionsvolumen: 10 µL, Detektorzelle: Ein-Kanal-Prototyp-Fluoreszenzzelle.

Die Zeit scheint reif zu sein für ein „Comeback“ der Mikro-LC. So jedenfalls lautete der allgemeine Tenor auf der zu Beginn des Jahres in Gent abgehaltenen Tagung zum Thema „Hyphenated Techniques in Chromatography“.

Die Mikro-LC bietet im Vergleich zu „klassischen“ (U)HPLC-Systemen eine Reihe von Vorteilen. Die drastische Reduzierung toxischer und teurer Lösemittel ist nach wie vor ein schlagkräftiges Argument für den Einsatz miniaturisierter Trenntechniken. Darüber hinaus bewirken Trennsäulen mit kleinerem Innendurchmesser bei konstantem Injektionsvolumen eine geringere Verdünnung der Elutionsbanden. Dies ist für viele Anwendungen der Bioanalytik von entscheidendem Vorteil, wenn nur kleinste Probenmengen zur Verfügung stehen.

Pumpensysteme
Trotz der genannten Vorteile gibt es allerdings auch Vorurteile in Bezug auf miniaturisierte Analysensysteme. Ein erster Aspekt ist die kommerzielle Verfügbarkeit von HPLC-Systemen, die mit Mikro-LC Säulen genutzt werden können. Der Einsatz von Fluss-Splittern kann die Verwendung von Mikro-LC Säulen an klassischen Systemen ermöglichen. Der Einsatz solcher Systeme ist jedoch nicht sinnvoll, denn je kleiner der Innendurchmesser der Trennsäule ist, desto wichtiger ist die Minimierung sämtlicher System- und Totvolumina, um die Trennleistung der Säule voll ausnutzen zu können. Entgegen der allgemeinen Auffassung sind dezidierte für die Nano- oder Mikro-LC entwickelte Systeme bereits seit mehr als 10 Jahren kommerziell erhältlich. Eines dieser Geräte wurde von der Firma Eksigent (heute Sciex) entwickelt und basiert auf dem Konzept des Microfluidic Flow Control. Pneumatische Spritzenpumpen erlauben eine splitlose Förderung der Eluenten, wodurch sich der Lösemittelverbrauch im Vergleich zu klassischen Systemen drastisch reduzieren lässt. Der Lösemittelgradient wird dabei prinzipiell sehr einfach generiert: Die Flüssigkeitsströme der mobilen Phasen vereinigen sich über ein T-Stück und vermischen sich passiv aufgrund der radialen Diffusion in der Kapillare. Auf diese Weise ist es möglich, das Gradientenverweilvolumen auf einen Mikroliter zu reduzieren, da kein zusätzlicher Mischer benötigt wird.

Wird eine Analyse bspw. bei einer Flussrate von 50 µL min-1 durchgeführt, so beträgt die Verzögerungszeit für den Gradienten lediglich 1,2 Sekunden. Hierdurch lassen sich extrem schnelle Zykluszeiten realisieren, sodass ein hoher Probendurchsatz erzielt wird.

Säulen
Ein zweiter Aspekt bezieht sich auf die weit verbreitete Ansicht, Säulen mit Innendurchmessern < 2,1 mm wären schwieriger zu packen und würden daher deutlich schlechtere Trennleistungen aufweisen als klassische Säulen mit Innendurchmessern zwischen 2,1 mm und 4,6 mm. In einer aktuellen Studie wurde deshalb der Frage nachgegangen, welche Trennleistung erreicht wird, wenn Mikro-LC Säulen mit einem Innendurchmesser von 300 µm auf einem Mikro-LC System verwendet werden. Hierzu wurde eine van-Deemter Analyse für zwei stationäre Phasen mit Partikeldurchmessern von 1,9 µm bzw. 3,0 µm durchgeführt. In Abbildung 1 ist deutlich zu erkennen, dass die Säule mit den größeren Partikeln eine größere theoretische Bodenhöhe H und damit schlechtere Trennleistung liefert. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Eddy-Diffusion für größere Partikel zu einem höheren A-Term in der van-Deemter Gleichung führt. Um nun die Packungsqualität beider Trennsäulen vergleichen zu können, wurde die reduzierte Bodenhöhe h berechnet. Diese sollte für gut gepackte Trennsäulen in einem Bereich zwischen 2,0 und 2,5 liegen. Anhand der Daten aus Tabelle 1 wird ersichtlich, dass dieser Wert für die mit den sub 2 µm Partikeln gepackte Trennsäule nahezu erreicht wird, wohingegen für die mit den 3,0 µm Partikeln gefüllte Trennsäule ein deutlich größerer Wert von 4,03 resultiert. Ein Erklärungsansatz für dieses Ergebnis ist, dass der Quotient aus Innendurchmesser der Trennsäule zum Partikeldurchmesser der stationären Phase für die mit den sub 2 µm Partikeln gepackte Trennsäule größer ist. Offensichtlich kann dadurch eine homogenere Packung erreicht werden.

An dieser Stelle sei angemerkt, dass die in der wissenschaftlichen Literatur verfügbare Datenbasis zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht ausreichend ist, um verallgemeinerbare Schlussfolgerungen zu ziehen. Generell ist zu konstatieren, dass bislang nur wenige Säulenhersteller miniaturisierte Trennsäulen mit einem Innendurchmesser < 1 mm im Produktportfolio haben. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Mikro-LC zum aktuellen Zeitpunkt nicht als Standardverfahren in Routine- oder Forschungslaboratorien etabliert ist und die Nachfrage nach entsprechenden Trennsäulen gering ist.

Detektoren
Die Kopplung der Mikro-LC mit der Massenspektrometrie (MS) ist relativ einfach zu realisieren, ohne dass gravierende Änderungen am MS-Detektor vorgenommen werden müssen. Einige Hersteller bieten z. B. die Möglichkeit, durch den Austausch eines Standard-Emittertips die vorhandene ESI-Quelle des Massenspektrometers zu nutzen. Im Unterschied dazu muss bei Verwendung der Nano-LC eine spezielle Nano-Elektrospray-Quelle für das Massenspektrometer verwendet werden, die i. d. R. aufwendig zu justieren ist. Obwohl sich die Massenspektrometrie in vielen Bereichen der Lebenswissenschaften etabliert hat, gibt es einige Anwendungen, für die ein massenspektrometrischer Detektor nicht erforderlich ist. Dies betrifft z. B. den Bereich der Qualitätskontrolle in der pharmazeutischen Industrie. Hier ist die UV-Detektion nach wie vor der „Goldstandard“. Auch die Anwendung weiterer Detektionstechniken wie Fluoreszenz- oder Lichtstreudetektion ist in vielen Bereichen von Bedeutung, sodass die Verfügbarkeit miniaturisierter HPLC-Detektoren ein weiteres notwendiges Kriterium darstellt, um die Mikro-LC möglichst umfassend einsetzen zu können. Auch wenn es eine Vielzahl unterschiedlicher UV-Detektoren gibt, die für die Mikro- oder sogar Nano-LC geeignet sind, werden häufig relativ lange Transferkapillaren benötigt, um die Säule mit dem Detektor zu verbinden. Dies liegt an der weit verbreiteten modularen Bauweise von HPLC-Systemen, die wie eine traditionelle „Hi-Fi“-Anlage aufgebaut sind. Eine elegante Möglichkeit, das Außer-Säulen-Volumen zu reduzieren, ist die Positionierung der Detektionszelle unmittelbar hinter der Trennsäule und deren optische Ankopplung über Lichtwellenleiter. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn zusätzlich eine MS-Kopplung stattfindet, da die UV-Zelle direkt zwischen Trennsäule und Ionenquelle integriert werden kann, wie dies schematisch in Abbildung 2 dargestellt ist.

Kommerzielle UV-Detektoren für die Mikro- und Nano-LC auf Basis der Lichtleitertechnologie werden u. a. von der Firma Knauer angeboten. Darüber hinaus wurde von uns in einem Forschungsprojekt ein Mikro-LC kompatibler Fluoreszenzdetektor entwickelt, dessen Zelle ebenfalls mit Lichtwellenleitern betrieben wird. Das Detektorvolumen liegt dabei je nach optischer Weglänge zwischen 0,05 und 5 µL. Eine beispielhafte Trennung von 15 polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen ist in Abbildung 3 dargestellt. Die Nachweisgrenze liegt bei einem Injektionsvolumen von 10 µL je nach Analyt zwischen 1 ng mL-1 und 10 ng mL-1.

Probenvorbereitung
Neben den Aspekten der Chromatografie und Detektion spielt natürlich auch die Probenvorbereitung eine entscheidende Rolle. Die Anbindung von Probenrobotern an miniaturisierte HPLC-Systeme ist in vielen Fällen einfach zu realisieren, da hier bereits Systemkomponenten kommerziell verfügbar sind. Dies gewährleistet, dass der gesamte analytische Workflow abgebildet werden kann. Ein wesentlich kritischerer Punkt ist in der Gesamtverknüpfung und Steuerung aller Komponenten zu sehen. Viele Produkte aus dem Bereich der miniaturisierten Trenntechnik stellen zum derzeitigen Zeitpunkt Insellösungen dar. Ein Problem besteht z. B. in der Anbindung und Steuerung des Gesamtsystems, das aus zwei oder mehr Einzelkomponenten unterschiedlicher Anbieter besteht. Hier ist die Weiterentwicklung sog. „Mastersoftware“ wie z. B. Chronos (Axel Semrau) oder Chromeleon (Thermo Fisher Scientific) notwendig, die eine einfache und möglichst vollständige Einbindung verschiedener Systemkomponenten ermöglicht.

Fazit
Obwohl die technischen Voraussetzungen für die Implementierung der Mikro-LC in Routinelaboratorien gegeben sind, steht die „Ampel“ derzeit noch auf Gelb. Erst wenn alle Hürden überwunden sind und auch die automatisierte Probenvorbereitung in den miniaturisierten Workflow eingebunden werden kann, wird die Mikro-LC ihren „Comeback“ erleben. Demnach ist heute der richtige Zeitpunkt um schon einmal Gas zu geben, wenn man den Start nicht verschlafen will.

Danksagung
Das Forschungsprojekt KF2025430AK3 wurde im Rahmen des Programms „Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand“ des Bundesministeriums für Wirtschaft und Technologie (BMWi) – Fördermodul Kooperationsprojekte – vom Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages gefördert.

Autoren
Thorsten Teutenberg1, Terence Hetzel1, Denise Loeker1, Juri Leonhardt1, Philipp Schulze2
1Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V., IUTA, Bliersheimer Str. 58-60, 47229 Duisburg, Deutschland
2Max-Planck-Institut für Kohlenforschung, Kaiser-Wilhelm-Platz 1, 45470 Mülheim (Ruhr), Deutschland

Kontakt
Dr. Thorsten Teutenberg
Institut für Energie- und
Umwelttechnik e. V. (IUTA)
Bereichsleiter Forschungsanalytik
Duisburg
teutenberg@iuta.de

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Haben Sie Fragen zur Anwendung und Technik im Bereich Mikro-LC und 2D-LC? Fragen Sie die Experten vom IUTA: adlichrom@iuta.de

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