Strategien zur Analytik von protein-gebundenen Kohlenhydraten

Den Proteinglykosylierung auf der Spur

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  • Abb. 1: Trennung von isomeren N-Glykanen auf einer Carbon (PGC)-Säule mit Detektion mittels Elektrospray-Massenspektroskopie (ESI-MS). Gezeigt ist die Massenspur für die Zusammensetzung 5 Hexosen + 4 N-Acetylglukosamine (GlcNAc) + 1 Fucose. Die Hexosen sind Mannose und/oder Galaktose.
  • Abb. 2: Glykopeptid-Spektrum vom IgG1 der Maus. Das Spektrum ist ein Abschnitt der Umkehrphasen-Chromatographie aufgenommen mittels ESI-MS und zeigt dreifach-geladene Ionen desselben Peptids mit verschieden großen Glykanen.
  • Abb. 3: Bearbeitetes ESI-MS Spektrum eines IgG Antikörpers. Man sieht deutlich die 162 Da Abstände aufgrund der unterschiedlichen Zahlen an Galaktose pro Molekül.

Die meisten Proteine im Serum bestehen nicht bloß aus Aminosäuren, sondern tragen auch Zuckerketten, welche in irgendeiner Form für ihre Faltung, Stabilität und oft auch Wirkung von Bedeutung sind. Natürlich stellt die Erforschung der vielfältigen biologischen Rollen der Proteinglykosylierung auf löslichen und zellständigen Proteinen, z.B. in Immunologie und Onkologie, den großen sinnstiftenden Rahmen dar. Die große Masse an Analytik findet aber wohl im Bereich der roten Biotechnologie, welche mittels Zellkultur Serumproteine wie Antikörper (IgG), Interferone, Interleukine, Wachstumsfaktoren wie Erythropoietin (EPO) oder Hormone wie Follitropin – allesamt Glykoproteine – herstellt. Die Glykosylierung von Pharmaka beeinflusst ihre Wirksamkeit, ihre Halbwertszeit im Patienten und kann unter Umständen zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. Zur Kontrolle der Proteinglykosylierung gibt es grundsätzlich drei Strategien: a) die Analyse der vom Protein abgetrennten Glykane; b) die Glykopeptid-Analyse und c) die Gesamtprotein-Analyse. Diese Vorgehensweisen sollen im Folgenden zusammen mit den jeweils wichtigsten analytischen Techniken vorgestellt werden.

Analytik freier Glykane

Dafür muss zunächst die Zuckerkette vom Protein getrennt werden. Bei den Asparagin-gebundenen N-Glykanen kann das sehr bequem mittels des Enzyms PNGase F erfolgen. Diese Peptid:N-Glykanase wird aus einem Bakterium namens Flavobacterium meningosepticum gewonnen, welches nach zwei Umbenennungen nun Elisabethkingia meningosepticum heißt. Das nun freie Glykan weist ein reduzierendes Ende auf und ist somit spezifischen Reaktionen mit chromo- oder fluorophoren Reagenzien zugänglich. Für die an Serin oder Threonin gebundenen O-Glykane gibt es leider kein solches Enzym. Behandlung mit Alkali in Gegenwart des Reduktionsmittels NaBH4 setzt sehr effizient reduzierte Oligosaccharide frei. Will man aber O-Glykane mit Fluorophoren derivatisieren, muss man zu wasserfreiem Hydrazin, einem eher unbeliebten Reagens, greifen.

Die Analytik reduzierender N- oder O-Glykane erfolgt heute meist nach Reaktion mit einem fluorogenen Amin, typischerweise 2-Aminobenzamid, 2-Aminobenzoesäure oder Procain auf hydrophilen Säulen.

Diese „hydrophilic liquid interaction“ Chromatographie (HILIC) trennt in erster Linie nach der Größe der Glykane und stellt für nicht allzu komplexe Proben, wie eben Antikörper eine hervorragende Analysenmethode mit verlässlicher Quantifizierung der Peaks dar. Bei komplexeren Gemischen geraten aber auch die modernen sub-2 µm UPLC Säulen an ihre Grenzen. Die Kopplung an ESI-MS gelingt für Procain-markierte Glykane recht gut – zumindest für nicht zu große Glykane. So können auch überlappende Peaks analysiert werden.

Für komplexe Gemische und für reduzierte O-Glykane steht als Ausweg die Massenspektroskopie mit ihrer deutlich höheren Auflösung bereit. Zunächst bietet sich MALDI-TOF MS an, welche mit einfacher Bedienung und hoher Schnelligkeit besticht. Da Hexosen, Pentosen, Desoxyhexosen, N-Acetylhexosamine und Sialinsäuren verschiedene Massen besitzen, lässt sich über die Masse jedenfalls die Zusammensetzung ermitteln. Es lässt sich aber nicht zwischen z.B. Mannose oder Galaktose unterscheiden und die isomere Struktur der Glykane bleibt verborgen. Das einfache, im Serum sehr häufige N-Glykan Hex5HexNAc4Fuc beispielsweise kann in über dreißig isomeren Formen auftreten. In gewissem Umfang lassen sich Informationen durch Fragmentierung der Analyten, also durch MS/MS erzielen, was bei MALDI meist durch Erhöhung der Laserenergie realisiert wird (Laser induced decay = LIF). Ein anderes Problem stellt die labile Sialinsäure dar, welche erst nach entsprechender Derivatisierung mittels MALDI-TOF erfasst werden kann. Ein Sonderfall der Derivatisierung ist die Permethylierung, d.h. die Umwandlung aller OH-Gruppen in Methylether, welche zwar relativ aufwendig ist, aber gute Fragmentionen-Spektren erzeugt.

Den Königsweg stellt wohl der Einsatz von LC-ESI-MS dar, wobei leider Umkehrphasen ausscheiden, weil Glykane daran nicht binden. Die etwas kapriziösen „porous graphitic carbon" (PGC) Säulen erweisen aber gute Dienste, da sie Strukturisomere sehr gut auftrennen. Somit trennen sie auch die alfa und beta Form reduzierender Glykane. Um nur einen Peak zu erhalten, arbeitet man mit reduzierten Zuckern. Die Methodik ist daher a priori auch für O-Glykane nach reduktiver alkalischer Hydrolyse gut geeignet. Den Nachteil, dass die verschiedenen Peaks sich in einer großen Datenmenge quasi verstecken und durch „Extrahierte Ionen-Chromatogramme“ (EICs) erst sichtbar gemacht werden müssen, wiegt der Umstand auf, dass Isomere meist getrennt werden und dann einerseits aufgrund ihrer Elutionsposition und andererseits aufgrund ihres Fragmentspektrums (MS/MS) identifiziert werden können. Dies stellt allerdings einen erst im Aufbau befindlichen Bereich dar, in dem geeignete Datenbanken erst lückenhaft vorhanden sind. Das Beispiel demonstriert die Trennung isobarer Glykane der oben erwähnten Zusammensetzung Hex5HexNAc4Fuc auf einer PGC-Säule (Abb. 1).

Etwas Beachtung verdient bei der LC-ESI-MS die Wahl der Polarität. Während für die meisten Analyten der positiv-Ionen Modus die Wahl ist, erlauben Glykane beide Polaritäten. Tatsächlich ionisieren auch hoch-sialylierte, sulfatierte und phosphorylierte Glykane im positiv-Modus recht gut und neutrale Glykane liefern wiederum überraschend effektiv negativ geladene Ionen. Positive Ionen ergeben einfache, leicht interpretierbare CID-MS/MS Fragmentspektren, welche allerdings kaum Anhaltspunkte für Isomerunterscheidung bieten und im Falle von Pseudomolekülionen, welche H+ enthalten, aufgrund der Tendenz zu intramolekularen Umlagerungen trügerisch sind. Dies kann man mit Alkali-Ionen oder einfacher durch Messung im Negativ-Modus verhindern. Die negativ-Ionen MS/MS Spektren zeichnen sich durch hohe Komplexität aufgrund von Ringbrüchen der Zucker aus. Interpretation wird hier schwierig, der Abgleich mit Datenbankeinträgen aber umso informationsreicher im Hinblick auf die isomere Struktur. Die relativen Retentionszeiten verschiedener Isomere stellen ein weiteres wichtiges Mittel zur Ermittlung der wirklichen Struktur eines Glykans dar (Abb. 1). Die Ermittlung molarer Verhältnisse verschiedener Glykane erweist sich aufgrund der sehr unterschiedlichen Größen und Ladungseigenschaften als problematisch.

 

Analytik von Glykopeptiden

Diese Schiene folgt dem Standardarbeitsmodus von Proteomik-Analysen. Das Glykoprotein wird mit einer Protease – meist Trypsin – verdaut und die Peptide und Glykopeptide werden mittels Umkehrphasen-Chromatographie gekoppelt an ESI-MS analysiert. Die Retention der Glykopeptide erfolgt hier beinahe ausschließlich aufgrund des Peptidanteils. Eine Ausnahme stellen sialylierte Proben dar, weil die meisten Umkehrphasen-Matrices eine geringe Anionenaustausch-Wirkung aufweisen. Wählt man statt der üblichen 0,1%  Ameisensäure ein Laufmittel mit höherer Ionenstärke, dann eluieren alle Glykoformen eines Peptids in einem sehr engen Zeitfenster und ein Summenspektrum zeigt anschaulich alle Glykoformen (Abb. 2). Recht häufig findet man dasselbe Peptid auch in unglykosylierter Form, welche 1 – 2 min nach dem Glykopeptid eluiert. Das Auffinden von Glykopeptiden in einem Proteinverdau kann über charakteristische B-Ionen oder über die errechnete Gesamtmasse (Peptid plus mögliche Glykan-Zusammensetzung) erfolgen.

Da auch die Ionisierungs- und Detektionseffizienz wesentlich vom Peptid bestimmt werden, ist – zumindest bei halbwegs großem Peptidteil – die Ableitung der molaren Proportionen inklusive der „site occupancy“ aus den Peakhöhen der Glykoformen möglich.

Gesamtmassen-Analyse

Dieser quasi holistische Ansatz, gerne auch als „top down“ Analyse bezeichnet, nützt den Umstand, dass bei der Elektrospray-Ionisierung großer Moleküle mehrfach geladene Ionen entstehen, welche mittels der hochauflösenden Massenanalysatoren in Q-TOF oder Orbitrap Geräten gemessen werden können. Entscheidend ist die effektive Entsalzung des Proteins Kieselgel und hier ist oft LC-ESI-MS mit wide-bore mit C4- oder C8-Belegung oder Monolith-Säulen aus hydrophobem Material, oft aber auch Größenausschluss-Chromatographie nützlich. Selbst ganze Antikörper können gemessen werden und die verschiedenen Glykoformen treten wunderschön hervor (Abb. 3). Notabene erfasst der „top down“ Ansatz alle Veränderungen des Proteins, so auch Lysin-Klipping bei IgG, Disulfidbrücken-Bildung, Pyroglutamat-Bildung, Acylierung etc. Die Interpretation solcher Spektren ist daher oft schwierig und benötigt Informationen von Analysen, wie sie in den vorigen Kapiteln vorgestellt wurden.
 

Autor
Friedrich Altmann

Kontakt
Prof. Dr. Dipl.-Ing. Friedrich Altmann

Universität für Bodenkultur Wien
Abteilung für Biochemie
Wien, Österreich
friedrich.altmann@boku.ac.at

Referenzen

[1] Castilho A, Beihammer G, Pfeiffer C, Göritzer K, Montero-Morales L, Vavra U, Maresch D, Grünwald-Gruber C, Altmann F, Steinkellner H, Strasser R.: An oligosaccharyltransferase from Leishmania major increases the N-glycan occupancy on recombinant glycoproteins produced in Nicotiana benthamiana, Plant Biotechnol J. 2018 Feb 26. doi: 10.1111/pbi.12906. [Epub ahead of print]

[2] Göritzer K, Maresch D, Altmann F, Obinger C, Strasser R.: Exploring Site-Specific N-Glycosylation of HEK293 and Plant-Produced Human IgA Isotypes, Proteome Res. 2017 Jul 7;16(7):2560-2570. doi: 10.1021/acs.jproteome.7b00121

 

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