Trends in der HPLC

Ist-Situation und kommende Entwicklungen

  • Abb. 1: Hochauflösende 1D-UHPLC Trennung eines tryptischen Verdaus von fünf Proteinen. Eine Kette von vier 250 mm langen Säulen wurde mit totvolumenfreien Kopplungsstücken basierend auf Viper-Verschraubungen (Thermo Scientific) aufgebaut. Stationäre Phase: Acclaim 120 C18 (Thermo Scientific), Temperatur: 30°C. Theoretische Peakkapazität berechnet aus der Peakbreite einzelner gut aufgelöster Peaks.Abb. 1: Hochauflösende 1D-UHPLC Trennung eines tryptischen Verdaus von fünf Proteinen. Eine Kette von vier 250 mm langen Säulen wurde mit totvolumenfreien Kopplungsstücken basierend auf Viper-Verschraubungen (Thermo Scientific) aufgebaut. Stationäre Phase: Acclaim 120 C18 (Thermo Scientific), Temperatur: 30°C. Theoretische Peakkapazität berechnet aus der Peakbreite einzelner gut aufgelöster Peaks.
  • Abb. 1: Hochauflösende 1D-UHPLC Trennung eines tryptischen Verdaus von fünf Proteinen. Eine Kette von vier 250 mm langen Säulen wurde mit totvolumenfreien Kopplungsstücken basierend auf Viper-Verschraubungen (Thermo Scientific) aufgebaut. Stationäre Phase: Acclaim 120 C18 (Thermo Scientific), Temperatur: 30°C. Theoretische Peakkapazität berechnet aus der Peakbreite einzelner gut aufgelöster Peaks.
  • Abb. 2: Pillar-Array-Column (Pharmafluidics); durch die „ordentliche“ Anordnung von Pillars soll sich eine engere Substanzzone im Vergleich zu einer “ Unordnung” im Falle von Teilchen in einer gepackten Säule ergeben.
  • Stavros Kromidas

Die Anforderungen an die HPLC-Analytik nehmen zu. Es handelt sich zunächst um Herausforderungen analytischer Natur, einige Stichworte dazu: Biotherapeutika, Lebensmittel, Substanz-Cocktails in biologischen Proben und Umweltproben. Damit zusammenhängend gehen strengere regulatorische und gesetzliche Anforderungen einher. Schließlich kommen wachsende wirtschaftliche Zwänge hinzu.

Die HPLC-Anlage von heute ist häufig eine UHPLC-Anlage. Allerdings werden diese eher selten im UHPLC-Modus, also bei ca. 1.000-1.200 bar und/oder Retentionszeiten kleiner 2-3 min, betrieben. Das ist auch selten notwendig, denn kaum mehr als 10% der Anwender müssen mehr als 60-80 Peaks quantifizieren oder partout 3 statt 6 min „warten“. Warum sollte man sich denn im Alltag auch unnötige Nachteile einhandeln, wie etwa stärkerer Verschleiß, häufige Leckagen, mangelnde Robustheit? Die Vorteile wie höhere Peakkapazität, niedrigere Nachweisgrenze oder sehr schnelle Trennungen sind in der Praxis doch nicht immer von Relevanz; oft zieht man eine robustere Analytik und dafür ein paar Minuten längere Analysenzeiten vor. Vor allem weil manuelle Probenvorbereitungsschritte, manuelles Re-Integrieren und notwendiges Daten-Handling und weniger die Trennzeit die Geschwindigkeitsbestimmende Schritte der Analysenkette sind.

Ist-Situation und mittelfristige Entwicklungen

1. Hard- und Software
Die UHPLC hat in der Methodenentwicklung für schwierige Proben, speziell im Spurenbereich sowie in der Hoch-Durchsatzanalytik, zweifelsohne einen enormen Schub gebracht. Nichtsdestotrotz wird an UHPLC-Geräten oft „klassische“ HPLC-Analytik bei bis ca. 600-700 bar betrieben, allerdings schneller und empfindlicher.

Anders liegt der Sachverhalt bei schwierigen Fällen. Ob 100°C oder auch 15°C, ≤ 2 µm, 1.200 bar, solche Trennungen ermöglicht eine UHPLC-Anlage, hier liegen ihre Stärken. Die porösen ≤ 2 µm-Teilchen können durch monolithisches Material oder Core- Shell-Teilchen ersetzt werden, dadurch werden längere – oder in Serie gekoppelte – Säulen/Kapillaren einsetzbar (Abb. 1).

Und für die noch schwierigeren Fälle?

Gerätetechnisch wären 200°C, ≤ 1 µm-Teilchen, 1 mm-Kapillare und bis zu ca. 5.000 bar notwendig und Trennungen unter diesen Bedingungen sind in Forschungsgruppen längst realisiert worden, allerdings werden diese für eine breite (!) Anwendung in absehbarer Zeit nicht Routine-tauglich. Dafür gibt es zahlreiche Gründe, nachfolgend seien einige genannt: ≤ 1 µm-Teilchen sind schwer reproduzierbar herzustellen, sie sind auch schwer gut zu packen, ihre Löslichkeit ist nicht zu vernachlässigen, die Korngrößenverteilung ist breit. Die bei den hohen Drücken erhöhte Kompressibilität der Flüssigkeiten erlaubt kaum einen konstanten Fluss in der Routine. Im übrigen sind die heutigen Geräte noch nicht gut genug, um die theoretisch mögliche Effizienz der ≤ 1 µm-Teilchen auszunutzen. Durch die Reibungswärme ergäbe sich zudem ein Temperaturgradient in der Säule von weit über 20°C. Schließlich erweist sich Materialermüdung bereits ab ca. 1.200-1.300 bar im Dauerbetrieb als ein ernst zu nehmendes Problem.

Mehrdimensionale Chromatographie

Daher geht man einen anderen Weg. Die bessere Lösung ist die 2D-Chromatographie, in einigen Jahren vielleicht sogar 3D-Chromatographie. Mehrdimensionale Chromatographie stellt einerseits einen selektiven „Detektor“ dar (beste Überprüfungsmöglichkeit der Peakhomogenität) und ist andererseits die schnellste Möglichkeit viele (ähnliche) Komponenten in einer komplexen Matrix/Probe zu trennen. Nach der 2. Dimension kann die Probe mithilfe von Schaltventilen zu unterschiedlichen Detektoren geführt werden. Infrage kommt sowohl optische Spektroskopie (DAD, FLD) und MS (HRMS, ESI, Orbitrap, IMS, Q-TOF, ICP-MS) als auch ELSD-, CAD- und NMR-Detektion. Bedeutung und Diversität derartiger Kopplungen dürften für schwierige Trennprobleme, wenn es also um hohe Peakkapazitäten und möglichst sichere Identifizierung geht, zunehmen.

Weitere Entwicklungen

Seit geraumer Zeit laufen evolutionäre Verbesserung der Instrumente. Durch Miniaturisierung und Verbesserung der Hardware bei den Detektoren wird versucht, Effizienz- und Empfindlichkeitsverluste im Falle von
1 mm/≤ 2 µm-Säulen zu begrenzen.

Zu einer permanenten Verbesserung gehören beispielsweise auch resistente und inerte Materialien, sowie Zubehörteile wie Mischkammer, Verbindungsstücke und Ventile, die mithilfe der 3D-Technik hergestellt werden. Ein weiterer Trend ist die automatisierte Probenvorbereitung. Zu erwähnen wären noch portable HPLC-Geräte, die in neuem Design und mit neuen Funktionalitäten nach 30 Jahren einen neuen Anlauf für die vor-Ort Analytik nehmen.

Es wird versucht, die Software so flexibel zu gestalten, dass mit einer (Cloud-basierten) Software „sämtliche“ Gerätschaften, wie LC, LCMS, GC, SFE-SFC, GCMS, SFC, 2D etc., bedienbar und steuerbar sind. Ferner wird die Funktionalität derart erweitert, dass sie den Anforderungen von 2D-Trennungen gerecht wird. Der real-time Vergleich von MS-Spektren, auch und gerade von Fragmenten, mit Spektrenbibliotheken steckt zwar noch in den Anfängen, wird dennoch immer wichtiger. In punkto Handling von Big Data/Meta-Daten läuft die Analytik anderen Branchen etwas hinterher. Das weiter oben Angeführte bezieht sich im Wesentlichen auf die Forschung, d. h. auf Herausforderungen bezüglich Trennungsverbesserung. In der Routine stehen dagegen Robustheit, Einfachheit, Reproduzierbarkeit im Fokus. Die Antwort der Hersteller hier lautet: „UHPLC-light“, also Geräte, die robuster und einfacher sind als die ursprünglich an die forschenden HPLC-Anwender adressierten Forschungsgeräte. Dazu gehören auch einfache, anwenderfreundliche, robuste, kleine und günstige Massendetektoren als in Serie geschaltete Detektoren zum DAD. Das Ziel ist hier ein sicheres Erfassen von „bekannten“ und erwarteten Daten mit moderner Technologie, Vermeidung von Wiederholmessungen, geringstmögliche Ausfallzeiten. Da ist man sicherlich auf einem guten Weg.

Die Trennung und Identifizierung von polaren Substanzen in biologischen Proben und Umweltproben nimmt an Bedeutung zu. Dies beflügelt die Weiterentwicklung und Verbreitung von HILIC und SFC. Diese Techniken, häufig in Kopplung mit der UHPLC, eröffnen neue analytische Möglichkeiten. Gerade SFC erlebt z. Z. einen Schub. Der relativ geringe Druck auch bei kleinen Teilchen in längeren Säulen/Kapillaren und damit einhergehend eine hohe Effizienz/Peakkapazität und die anschließend eher unproblematische Kopplung mit MS bescheren SFC eine zunehmende Aufmerksamkeit. Neben kleinen, polaren Molekülen stehen Biomoleküle aus verständlichem Grunde im Mittelpunkt des Interesses. HPLC-Anbieter liefern ≤ 2 µm poröse Teilchen mit, neben der klassischen C4, zusätzlichen Funktionalitäten, Core-Shell-Materialien mit 450-1.000 Å, organische Monolithen in Kapillaren und IEC x HPSEC-Kopplung. Die wachsende Bedeutung von Biomolekülen könnte der Kapillar-Elektrochromatographie (CEC) zu einem gewissen Durchbruch verhelfen. Die Vormachtstellung der RP-HPLC bleibt unangefochten. Bezüglich der Chemie der Oberfläche erleben wir seit Jahren eine zunehmende Zahl an polaren Phasen wie Phenyl/Biphenyl und Pentafluorphenyl sowie insbesondere Mixed-Mode-Phasen oder Phasen mit einer zusätzlichen Ladung, also „hydrophobic-hydrophilic balanced phases“.

Die nächsten Jahre

Es liegt auf der Hand, dass eine Prognose schwierig ist. Man kann nur anhand des heutigen Wissenstands einige mögliche Entwicklungen skizzieren.

Trennmedien

Möglicherweise werden eher kurze und auch eher lange Säulen an Bedeutung gewinnen, Säulen mittlerer Länge (125-200 mm) werden immer seltener verwendet. Trennungen von bis zu 15-20 Peaks sind mit
≤ 100 mm zu bewerkstelligen, für komplexere Proben mit ≥ 60-70 Peaks sind 250 mm-Säulen/Kapillaren bzw. Säulenkopplungen bzw. 2D-Techniken notwendig. Mixed-/Multi-Mode-Säulen mit orthogonalen Selektivitäten sowie Polymer-basierte Materialien könnten an Wichtigkeit gewinnen. Die seit 4-5 Jahren diskutierten und teilweise vorgestellten 3D-Säulen und Pillar-Array-Columns müssen zunächst ihre Praxistauglichkeit unter Beweis stellen (Abb. 2).                                                
Monolithen bleiben definitiv ein Thema, restliche Entwicklungen wie Chip-Säulen, mikro-/nano-LC und immobilisierte Discs dürften eher Nischen besetzen.

Hardware

Es wird bei den Ausführungen weiter unten angenommen, dass das Prinzip der HPLC in etwa konstant bleibt: Der Eluent wird durch eine Pumpe befördert, die Information wird durch Trennung und spezifischer Detektion gewonnen. Sollten Alternativen, die übrigens seit längerem in der Diskussion sind, doch Realität werden, könnten auch ganz neue Prinzipien genutzt werden, z. B anstelle eines mechanischen- ein elektronosmotischer Fluss, als Trennmedium ein Array von Substanz-spezifischen Sensoren an diversen Oberflächen angebracht, universelle Acoustic Flame Detection (AFD).

Es scheint eine Differenzierung des Gerätedesigns einzutreten, die evtl. noch an Fahrt gewinnen wird. Auf der einen Seite einfache, robuste, teilweise spezialisierte Geräte für die Routine bis zum spezifischen Analysator: Smartphones mit speziellen Aufsätzen zur Bestimmung von einfachen Parametern und Funktionsintegration auf hochspezialisiertem Silizium-Chip. Auf der anderen Seite vollautomatische 2-/3D-Geräte mit eingebauter Intelligenz (siehe auch nächsten Abschnitt) und multiplen Detektoren zur automatischen Methodenentwicklung.

Smart-HPLC

Alexa und Siri, Internet der Dinge, intelligente Oberfläche und intelligenter Kühlschrank. Die omnipräsente und gepriesene totale Vernetzung und Kommunikation als Realität und Vision ist natürlich auch für das HPLC-Labor von morgen ein Thema. Nachfolgend werden Beispiele genannt, die technisch möglich wären. Es sind Ansätze, die in anderen Branchen bereits Realität sind bzw. als Prototypen gerade getestet werden. Was davon den Weg ins Labor findet, wird sich noch zeigen müssen:

Uneingeschränkte Kommunikation zwischen Geräten bzw. Geräteteilen, Vernetzung mit dem WLAN. Einige Anwendungen wären:

Die Pumpe „merkt“, dass sie Luft enthält, öffnet das Purgeventil, erhöht den Fluss und nach Aufheben des Problems wird das Purgeventil wieder geschlossen und die Messung wiederholt. Natürlich erfolgt eine vollständige Dokumentation.

Der eingebaute pH-Wert-Sensor registriert eine Verschiebung des pH-Wertes und es erscheint eine Meldung mit exakter Diagnose: „Die Verschiebung der Retentionszeit von Peak Nr. 5 liegt an einer Verschiebung des pH-Wertes, da die Retentionszeit der übrigen neutralen Komponenten konstant geblieben ist, ferner hat sich auch der Asymmetriefaktor von Peak Nr. 5 verändert und nicht zuletzt seine Peakfläche, da dessen UV-Absorption pH-Wert-abhängig ist…“

Füllstandsensoren überwachen Vorrats- und Abfallgefäß und sie sind direkt mit dem Bestell- und Entsorgungsmanagement verbunden.

Die Säulen enthalten einen „smart column chip“ (SCC) mit Säulendaten, gespeicherten Methoden inkl. Spülprozedur; nach dem Einbau werden die Daten automatisch übernommen, die Sequenz kann starten. Schließlich teilt die Säule mit, wenn sie ausgetauscht werden soll.

Vorausschauende Wartung
Die Anlage wird mit chemischen, physikalischen und elektronischen Sensoren bestückt. Je nach Einsatzgebiet des Gerätes bzw. besonderen Wünschen des Kunden können sie sehr spezifisch sein. Der Anwender/Hersteller hat somit 24/7 Infos zum aktuellen Zustand des entsprechenden Moduls. Anhand der gespeicherten Informationen kann frühzeitig und nicht erst nach Auftreten des Problems reagiert werden. besipielsweise „merkt“ der Sensor, dass bald eine Deuteriumlampe benötigt wird oder dass der Saphirkolben sich schief bewegt. Er meldet sich beim Anwender/Hersteller und erstattet genau Bericht, der Serviceingenieur weiß, was an welchem Gerät in welchem Labor zu tun ist und was er mitzubringen hat.

Argumentative Maschinen
Diese Maschinen enthalten einen fachspezifischen allgemeinen Inhalt, z. B: Theorie der Chromatographie, Spezifika von Trennmethoden wie HILIC oder Ionenaustauschchromatographie, spezifische Optimierungsalgorithmen, ferner einen Part mit individuellem Inhalt, z. B. Kunden-/Matrix-/Substanzklassen-spezifische Infos. Der Inhalt wird mit Computerlinguistik und –semantik kombiniert. Ein Dialog zwischen Anwender und Maschine in gesprochener Form führt schließlich zu einem maßgeschneiderten Vorschlag inkl. alternativer Lösungsansätzen.

Intelligente Datenanalysen
Die verfügbaren Daten werden besser als heute genutzt. Die Werte aus Retentionszeiten, Quotient aus Fläche und Höhe, Quotient von UV-Intensitäten bei unterschiedlichen Wellenlängen, MS-Spektren nach unterschiedlicher Ionisierung etc. ergeben mehrdimensionale Bilder, die aufgrund der Datenfülle recht Substanz-spezifisch sein dürften.
Erzeugte Spektren werden zu Monitoring-Zwecken automatisch mit Tausenden von Spektren in Bibliotheken verglichen (z. B. Umweltanalytik, Lebensmittelüberwachung, Produktion).
Neben statistischen Berechnungen werden mit den Daten Trendanalysen durchgeführt und mittels Principal Component Analysis (PCA) wird auf etwaige Zusammenhängen geprüft.

Automatischer Universalanalysator
Die feste Probe wird im Automaten in drei parallelen Ansätzen mit drei Lösungsmitteln extrahiert, filtriert und aliquotiert. Es wird jeweils ein NMR-, ein UV- und ein MS-Spektrum aufgenommen. Anhand der Löslichkeit, die durch Konzentrationsmessungen ermittelt wird und den Infos aus den Spektren wird die Probe zur Kapillar-GC, SFC oder UHPLC geführt. Der Analysator verfügt über Eluenten- und Säulenschaltventile, um mithilfe von QbD-basierter Optimierungssoftware automatisch die Methode zu entwickeln. 2-/3D-Trennungen sind ebenso möglich. Über Schaltventile werden nach der Trennung Aliquote zu unterschiedlichen Detektoren geführt. Parallel zur Datenanalyse erfolgt der Vergleich der aufgenommenen Spektren mit Bibliothekspektren, Ergebnis: „Ja/nein“ bzw. Erscheinen einer/mehrerer Zahl(en), auf Wunsch auch ein Kommentar und bei Bedarf eine „to do“-Empfehlung.

Fazit

Zusammengefasst könnte man zur Zukunft der HPLC als mögliche Entwicklungen schlussfolgern, dass der Druck zumeist unter ca. 2.000 bar bleibt, die Teilchen nicht wesentlich kleiner werden und die Bodenzahl als Attribut an Ausstrahlungskraft verliert. Die SFC gewinnt weiter und die mehrdimensionale Chromatographie gewinnt stark an Bedeutung. Die Anwender werden häufiger zwischen den Trenntechniken wechseln, den/die HPLC-Anwender(in) wird es immer seltener geben. Immer häufiger kommen (mindestens) zwei Detektoren zum Einsatz, auch in der Routine, die Geräte werden smart und intelligente Softwarelösungen werden Entscheidungen erleichtern.

Autor
Stavros Kromidas

Lebenslauf
Stavros Kromidas
Studium der Chemie und Promotion an der Universität des Saarlandes in Saarbrücken über die Entwicklung von neuen chiralen Phasen für die HPLC. Verkaufsleiter Norddeutschland bei Waters, 1989 Gründung der Novia GmbH und Geschäftsführung bis 2001. Seit 2001 Fachbuchautor und Referent für HPLC und Validierung. Schwerpunktthemen seiner Tätigkeit in den letzten Jahren sind Vergleich und Auswahl von stationären Phasen, Gradientenoptimierung und der Einsatz von moderner HPLC/UHPLC im Alltag

Kontakt  
Dr. Stavros Kromidas

Blieskastel, Deutschland
info@kromidas.de

Probekapitel Kromidas „Das HPLC-
MS-Buch für Anwender“

Chemgapedia-Lerneinheit zur 2D-LC

Kontaktieren

Microsite Fortschrittliche Chromatographie


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