Verbesserte Nachweisgrenzen

Detektion von Chrom und anderen Spurenelementen im Vollblut

  • Abb. 1: Repräsentative Kalibrierkurven.Abb. 1: Repräsentative Kalibrierkurven.
  • Abb. 1: Repräsentative Kalibrierkurven.
  • Abb. 2: Wiederfindungsraten der zertifizierten ­Referenzmaterialien (CRMs) und Matrix-Spikes  als Funktion des analysierten Elements (links) und als Funktion der Zeit (rechts). Die gemessenen Konzentrationen der CRMs und der Matrix-Spikes ­lagen innerhalb der spezifizierten Unsicherheit (80-120%, grün markiert). Die Matrixspikes ­wurden über 8 Stunden reproduzierbar richtig ­gemessen, was die Robustheit des Verfahrens und des ­Instrumentes beweist.
  • Abb. 3: Konzentration von Elementen, die im ­Vollblut typischerweise schwer zu bestimmen sind, als Funktion der Zeit (links). Über 8 Stunden wurden nur geringe Abweichungen der Elementkonzentration festgestellt. Der Matrix-Spike zeigte während des gesamten Messzeitraums hervorragende Wiederfindungsraten (rechts). Alle Wiederfindungs­raten lagen zwischen 80-120% (grün markiert) und die Konzentration der Vollblutproben lag im Referenzbereich des menschlichen Blutes. Die ­Vanadiumkonzentration in der Blutprobe lag unter der MQL und ist nicht dargestellt. Die zusätzliche Vanadiumkonzentration im Matrix-Spike wurde genau quantifiziert.
  • Tab. 1: Konzentration der für die Kalibrierung verwendeten Standards.
  • Tab. 2: Analyt-Ionen und entsprechende polyatomare Störungen  bei der Analyse von Vollblut mittels ICP-MS.

Der Blutkreislauf ist ein Transportsystem, das den Körper kontinuierlich mit benötigtem Sauerstoff, Vitaminen, Fettsäuren und Nährstoffen versorgt. Viele Elemente sind im Blut gelöst oder in Proteine eingebettet, die für die einwandfreie Funktion des Organismus erforderlich sind. Der wohl bekannteste Vertreter ist das Eisen. Das Vorhandensein von zu hohen oder zu niedrigen Konzentrationen bestimmter Elemente kann ein Hinweis auf einen Mangel oder eine Vergiftung sein, welche beide zu schweren Krankheiten führen können. Aus diesem Grund wird die Konzentration von Metallen in biologischen Proben wie Blut, Serum, Plasma und Urin routinemäßig analysiert. In den letzten Jahren hat sich die induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) aufgrund ihrer Geschwindigkeit und niedrigen Nachweisgrenzen zur Methode der Wahl für die Analyse dieser Probentypen entwickelt. [1]

Vollblut ist eine komplexe Probenmatrix mit festen und flüssigen Komponenten und einem relativ hohen Kohlenstoffgehalt, der von den Proteinen und Lipiden im Blut stammt. In einigen Fällen genügt es, die Elementkonzentration im Serum zu bestimmen. Einige Elemente befinden sich jedoch teilweise in der unlöslichen Blutfraktion, dem Hämatokrit, was die Analyse von Vollblut erforderlich macht. Die Probenvorbereitung von Vollblutproben ist aufgrund ihrer festen und flüssigen Bestandteile schwierig, da feste Bestandteile nicht ausfallen dürfen. Aus diesem Grund wurden verschiedene Verfahren zur Probenvorbereitung entwickelt. [2]
Hier wird eine robuste Methode vorgestellt, um ein metallisches Profil von Vollblut mit Konzentrationen von ppt bis ppm unter Verwendung von Alkaliverdünnung für eine einfache und schnelle Probenvorbereitung zu erhalten. Mit der patentierten Boost-Technologie können Elemente wie z.B. As, Se, Cr und V, die typischerweise im Vollblut mit ICP-MS schwer zu messen sind, im ng/L-Bereich korrekt analysiert werden. Die genaue Quantifizierung aller Elemente während einer Langzeitmessung von 8 Stunden bewies die Anwendbarkeit der Methode für die Routineanalyse von Vollblut.
 
Interferenzmanagement
Abhängig von der Probenmatrix werden bestimmte Elemente durch mehratomige Moleküle mit einem mit dem Analyten identischen Masse-Ladungs-Verhältnis gestört.

Dies führt zu einer scheinbar zu hohen Analytkonzentration, wenn die Störung nicht beseitigt wird. Polyatomare Störungen lassen sich in solche unterteilen, die durch kinetische Energieunterscheidung (physikalischer Prozess) beseitigt werden können und solche, die durch eine chemische Reaktion beseitigt werden können. Typischerweise werden argonbasierte Störungen beseitigt, indem ein reaktives Gas, wie beispielsweise Wasserstoff, in eine Kollisionsreaktionszelle eingespritzt wird. Elemente und störende polyatomare Moleküle, die typischerweise in einer Blutmatrix gebildet werden, sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Bei herkömmlichen ICP-Massenspektrometern befindet sich die Kollisionsreaktionszelle zur Entstörung direkt vor dem Quadrupol. Das hier verwendete Spektrometer ist mit einer im Skimmerkonus integrierten Kollisionszelle (iCRC) ausgestattet, und damit in der Lage, störende polyatomare Moleküle direkt nach ihrer Bildung und vor dem Eintritt in die Ionenoptik zu entfernen. Ähnlich wie bei herkömmlichen Kollisionsreaktionszellen wird Gas in das iCRC eingespritzt, um Störungen zu beseitigen.
Das Vorhandensein von reaktiven Gasmolekülen im Ionenpfad führt zu Kollisionen von Gasmolekülen und Analytionen. Dadurch wird die Flugbahn der Analytionen verändert und damit weniger Ionen in das Massenspektrometer extrahiert. Dies reduziert direkt die Empfindlichkeit für diese Elemente. Dadurch wird die Empfindlichkeit für diese Elemente direkt reduziert. Mit der Boost-Technologie wird eine positive Spannung an den Skimmerkonus angelegt. Die Analytenionen werden dann gleichmäßig wieder fokussiert und beschleunigt, was die Empfindlichkeit deutlich verbessert.
 
Materialien und Methoden
Für die Analyse wurde ein Plasma Quant MS Q mit ASPQ3300 Autosampler, Platin-Konen, Micro Mist (0,4 mL/min) Zerstäuber, Scott-Sprühkammer und einer Plasmafackel mit 2,4 mm Injektor verwendet.
 
 
Proben und Reagenzien
Alle Proben und Standards wurden mit hochreinen Reagenzien hergestellt. Für die Kalibrierung und Probenverdünnung wurde eine matrixangepasste Lösung verwendet.
 
  • Um die festen Bestandteile des Blutes zu stabilisieren und den Kohlenstoffgehalt nachzuahmen, enthielt diese Lösung de-ionisiertes Wasser. <0,055 mS (ELGA Lab), 2% NH4OH, (Sigma-Aldrich), 2% Isopropanol (Honeywell), 0,1% TritonX100 (Merck).
  • Alle Proben wurden um den Faktor 20 verdünnt.
  • Aus einer Stammlösung wurden Kalibrierlösungen unter Verwendung von Einzelelementstandards hergestellt. Die für die Kalibrierung verwendeten Konzentrationen sind in Tabelle 1 dargestellt.
  • Alle Experimente wurden unter Nicht-Reinraumbedingungen durchgeführt, um die Robustheit der Methode für eine standardisierte Laborumgebung zu beurteilen.
Von den 20 Analyten sind sechs repräsentative Kalibrierkurven (Be, Al, Cr, Se, Cd und Tl) in Abbildung 1 dargestellt. Für alle Elemente wurden Korrelationskoeffizienten >0,9999 erreicht. Die erhaltenen Korrelationskoeffizienten, niedrigen RSDs und geringen Abweichungen der einzelnen Standards von der Regressionskurve zeigen die hervorragende Qualität der Kalibrierung unter Standard Laborbedingungen auch bei niedriger ng/L-Konzentration und in einer matrixangepassten Lösung.
 
 
Geräteeinstellungen und Methodenparameter
Mehratomige Interferenzen (spektrale Störungen) z. B. auf Argonbasis wurden beseitigt, indem Wasserstoff als Reaktionsgas über die integrierte Kollisionsreaktionszelle (iCRC) eingespritzt wurde. Der hohe Kohlenstoffgehalt der Vollblutmatrix führt zur Bildung von 40Ar12C+ Spezies, die das empfindlichste Isotop von Chrom, 52Cr, direkt stören. Um höchste Empfindlichkeit und niedrigste Nachweisgrenzen für im Reaktionsgasmodus gemessene Elemente zu erreichen, wurde die Boost-Technologie eingesetzt. Im Boost-Modus wird eine positive Spannung an den Skimmkonus angelegt, um den Empfindlichkeitsverlust bei der Verwendung von Reaktionsgasen auszugleichen.
Interne Standards (Li, Rh und Ir) wurden der Probe online über ein Y-Stück in einer Konzentration von 10 µg/L hinzugefügt. Die verwendeten Methodenparameter sind in Tabelle 3 (online verfügbar) aufgeführt.
 
Ergebnisse und Diskussion
Die Hintergrund-Äquivalenzkonzentration (BEC), die Nachweisgrenzen (LOD) und die Grenzen der Quantifizierung (LOQ) wurden bestimmt, um die Leistung der Methode zu beurteilen. Die Instrumentendetektionsgrenzwerte (IDL) wurden berechnet, indem eine Rauschanalyse der gemessenen Blindlösung (Drei-Sigma-Methode) durchgeführt wurde. Die erhaltenen LODs und LOQs wurden in Methodendetektionsgrenzen (MDL) und Methodenquantifizierungsgrenzen (MQL) umgewandelt, indem sie mit einem Faktor von 20 multipliziert wurden, wie er für die Probenverdünnung verwendet wird.
Für alle Elemente, die in Spurenkonzentration im Vollblut enthalten sind, wurden Instrumentennachweisgrenzen im unteren ppt-Bereich ermittelt. Die in Tabelle 4 (online verfügbar) aufgeführten IDLs wurden für diese spezifische Methode, Matrix und Kalibrierung bestimmt. Für eine andere Matrix oder ein anderes Verfahren können die LODs durch den Einsatz von Chemikalien mit höherer Reinheit oder durch Arbeiten unter Reinraumbedingungen verbessert werden. Um die Genauigkeit der Methode nachzuweisen, wurden zertifizierte Referenzmaterialien (CRMs) und menschliche Vollblutproben mit einer bekannten Konzentration an Analyten analysiert. Die folgenden elementaren Konzentrationen im menschlichen Blut und in den zertifizierten Referenzmaterialien (CRMs) wurden gemessen (Tab. 5; online verfügbar). Die Referenzkonzentration (5-95% Perzentil) des menschlichen Blutes und das Konfidenzintervall der CRMs sind in Klammern angegeben. [3-5]
Um eine Messung von Blutproben verschiedener Probanden nachzuahmen, wurde das Probeneinführsystem nach jeder Analyse gespült. Zuerst wurden Blutproben gemessen, gefolgt von der Messung von Matrix-Spikes zur Untersuchung der Spike Wiederfindung sowie einer Blindlösung zur Überwachung des Auswaschverhaltens. Die in den zertifizierten Referenzmaterialien gemessenen Konzentrationen entsprechen der Spezifikation. Die Elementkonzentration in der Vollblutprobe lag innerhalb des 5-95%-Perzentils des Referenzbereichs des menschlichen Blutes, was die Genauigkeit der Methode belegt. Darüber hinaus wurden 8 Stunden lang Matrix-Spikes von menschlichem Vollblut, denen eine bekannte Menge Analyt zugesetzt wurde, gemessen, um die Robustheit der Methode und des Instruments zu demonstrieren. Um den Matrix-Spikes genau messen zu können, wurde die Menge des zugesetzten Analyten gleich oder größer als die Elementkonzentration in der Probe gewählt. Zusätzlich wurden 10 % des Kalibrierstandards 3 oder des Kalibrierstandards 4 der Blutprobe zugesetzt. Stabile und korrekte Wiederfindungsraten des Matrix-Spikes wurden über 8 Stunden, bzw. einen ganzen Arbeitstag (Abb. 2).
Die Anwendung der Boost-Technologie in Kombination mit der Injektion von Wasserstoff als Reaktionsgas erwies sich als sehr effektiv für die Messung von V, Cr, As und Se, wie die Genauigkeit der erhaltenen Ergebnisse und die erreichbaren Nachweisgrenzen im ng/L-Bereich zeigen. Präzise und genaue Messungen des menschlichen Blutes wurden über einen Zeitraum von 8 Stunden durchgeführt, die einen typischen Arbeitstag abdecken und die Robustheit der Methode und des Instruments belegen. Für diesen Zeitraum wurden nur geringe Abweichungen der ermittelten Konzentrationen im menschlichen Vollblut erhalten (Abb. 3).
 
Fazit
In den letzten Jahren hat sich die Bedeutung der Analyse von Spurenelementen in biologischen Proben gezeigt, da das metallische Profil zur Vorhersage von Krankheiten oder zur Anzeige von Mängeln genutzt werden kann. Biologische Proben wie Blut sind jedoch aufgrund ihrer komplexen Probenmatrix in der Regel schwer zu analysieren. Mit dem PlasmaQuant MS Q mit der patentierten Boost-Technologie kann das metallische Profil von Blut mit Nachweisgrenzen im ng/L-Bereich genau gemessen werden. Der volldigitale Detektor vermeidet ungenaue und zeitaufwändige Kreuzkalibrierungen mit seiner Dämpfungsfunktion, die es ermöglicht, Elemente im Bereich von ppt bis ppm zu messen. Die integrierte Kollisions- und Reaktionszelle in Kombination mit der Boost-Funktionalität ermöglicht die routinemäßige Messung stark gestörter Elemente wie Cr im Vollblut mit hoher Genauigkeit, Präzision und Empfindlichkeit. Niedrigste Nachweisgrenzen, Verfahrensrobustheit, kosteneffizienter Betrieb durch geringen Argonverbrauch und die intuitive Software mit integrierten Qualitätskontrollen machen die verwendete Geräteserie zu einer guten Lösung für die Routineanalytik biologischer Proben.
 
 
Autor
René Chemnitzer
 
 
Kontakt   
Dr. René Chemnitzer

Produktmanager ICP-MS
Analytik Jena
Jena, Deutschland
rene.chemnitzer@analytik-jena.de
 
 
 
 
Literatur
 
1) Anwendungshinweis: Multi-Element-Analyse biologischer Materialien mittels ICP-MS unter Verwendung von Alkali-Verdünnung

2) Anwendungshinweis: Vorbereitung biologischer Proben für die Elementaranalyse

3) Goullé J-P. et al., Metallisches Profil von Vollblut und Plasma in einer Serie von 106 gesunden Freiwilligen, Journal of Analytical Toxicology, 2013, 37, 401-405

4) Rodushkin I. et al., Multi-Element-Analyse von Körperflüssigkeiten durch doppelfokussierte ICP-MS, Transworld Res. Network. Aktuelle Res. Entwickeln. Pure & Applied Chem., 2001, 5, S. 51-66.

5) Rodushkin I., Ödman F., Branth S. Multielementanalyse von Vollblut mittels hochauflösender induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie, Fresenius J. Anal. Chem., 1999, 364, 338-346.
 

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