Verdampfender Lichtstreudetektor im GMP Umfeld

  • Dipl. Chem. Ernst J. Maier, Dr. Franz Menzinger, Christian Scheidl (von links nach rechts)
  • Abb. 1: ELSD Prozess a) Die Verneblung des Eluenten findet im Nebulizer und in der Verneblungskammer findet die angesprochene Selektion der Tröpfchen nach ihrer Größe statt. Große Tröpfchen scheiden sich an der Glaswand ab und verlassen die Verneblungskammer über das Siphon. Kleine Tröpfchen gelangen in die Drift Tube b) in der die Verdampfung des Tröpfchens stattfindet worauf es dann im Anschluss im Detektor zur Detektion des Streulichts im Winkel von 120 ° kommt.  
  • Abb. 2: Einfluss des Stickstoffdrucks auf die erhaltene Peakfläche bei Injektionen derselben Standardlösung. Die Abbildung zeigt 2 unterschied­liche Analyten als Beispiel.
  • Abb. 3: Einfluss der Drift Tube Temperatur auf die erhaltene Peakfläche bei Injektionen derselben Standardlösung. Die Abbildung zeigt 2 unterschied­liche Analyten als Beispiel.
  • Abb. 4: Beispiele für Einsatzmöglichkeiten eines ELSD: a) Analyse von vier Aminoglykosidantibiotika, b) Analyse einer binärer Mischung eines Aminoglykosidantibiotikums mit einem Polypeptidantibiotikum und c) Analyse ­eines halbflüchtigen Insektizids in einer komplexen pharmazeutischen ­Formulierung (Analyt eluiert bei 15 Minuten)

Einsatz eines verdampfenden Lichtstreudetektors im GMP Umfeld. Kalibrierung und kritische Parameter. Durch die universelle Einsatzmöglichkeit des verdampfenden Lichtstreudetektors (ELSD) hält dieser immer mehr und mehr auch Einzug in Labors der Qualitätssicherung von pharmazeutischen Betrieben.

Die Applikation eines ELSD stellt allerdings spezielle Anforderungen an den Operator und vor allem an die Infrastruktur des Labors. Für verlässliche Analysenergebnisse, speziell im GMP-Umfeld, ist die Kenntnis von ­Eigenheiten und kritischen ­Parametern dieses Detektors unerlässlich.

 

Einleitung

Der verdampfende Lichtstreudetektor, kurz ELSD (evaporative light scattering detector) findet heute mehr und mehr auch in der pharmazeutischen Analytik Einsatz. Er ist bereits seit ca. 1978 bekannt [1], aber erst in den letzten Jahren wurde die Empfindlichkeit dieser Detektoren durch Optimierung mehrerer Geräteparameter erheblich verbessert.

Die Funktionsweise, und das Funktionsprinzip dieses Detektors zu verstehen ist grundlegend für das weitere Verständnis und spielt somit eine zentrale Rolle bei der Optimierung der Infrastruktur in einem Labor.

 

Theorie des ELSD

Die Technik des verdampfenden Lichtstreudetektor ermöglicht die direkte Detektion von Analyten, die über keinen oder nur einen schwachen Chromophor verfügen und dadurch bedingt nicht oder nur sehr schlecht mit einem UV/VIS - Spektrophotometer detektiert werden können.

Beispielhaft seien hier die Aminoglykosidantibiotika Neomycin und Tobramycin genannt. Der Analyt muss einerseits weniger flüchtig als die mobile Phase und andererseits bei der entsprechenden Verdampfungstemperatur in der Drift Tube stabil sein.

Im ersten Schritt des ELSD-Prozesses erfolgt eine Zerstäubung des Eluenten im Nebulizer mit z. B. Stickstoff 99,9 % als Zerstäubergas (Abb. 1a).

Die Form der Verneblungskammer ist darauf ausgelegt, eine Auswahl von Tröpfchen als Funktion ihrer Größe vorzunehmen. Detektiert wird Streulicht, das durch Partikel im Detektor verursacht wird.

Zu große Tröpfchen werden gegebenenfalls bei niedrigerer Temperatur nicht mehr vollständig evaporiert.

Sie gelangen nicht vollständig verdampft von der Drift Tube in die Detektorzelle, in der es durch den noch vorhandenen Resttropfen zu einer Lichtstreuung kommt, die detektiert wird. Es erfolgt also in der Verneblungskammer eine Selektion von Tröpfchen in der Art und Weise, dass sich große Tropfen an der Glaswand abscheiden und über ein Siphon in den Abfall geleitet werden und nur kleine Tröpfchen in die Drift Tube gelangen können.

Nach der Vernebelung und der Selektion der Tröpfchen erfolgt nun die Verdampfung der feinen Tröpfchen in der Drift Tube (Abb. 1b). Diese wird auf einen einstellbaren Wert ­geheizt, wobei die zu wählende Temperatur vom Eluenten, vom Analyten und vom Gerätetyp abhängt. Je weniger organisches Lösungsmittel (z. B. Acetonitril) sich dabei in der mobilen Phase befindet, umso höher muss diese Temperatur gewählt werden, um eine vollständige Verdampfung zu gewährleisten.

Die Detektionseinheit selbst besteht aus einer optischen Zelle, die darauf ausgelegt ist, das durch die Partikel verursachte Streulicht in einem Winkel von 120 ° mittels Photomultiplier zu detektieren. Alle Substanzen, die weniger flüchtig sind als die mobile Phase erreichen nach dem Verdampfen des Eluenten als Partikel mit dem Stickstoffstrom die Detektionszelle, welche direkt an die Drifttube angeschlossen ist und verursachen eine Lichtstreuung.

 

Kalibrierung

Bei der Kalibrierung wird eine nichtlineare Regression verwendet (polynomisch, 2. Ordnung) die durch die an der Lichtstreuung beteiligten Prozesse nötig wird [2]. Diese Prozesse sind die Rayleigh-, die Mie-Streuung und die klassische Reflexion bzw. Brechung [3].

Der Einfluss der einzelnen Prozesse ist abhängig von der Größe der Tröpfchen nach der Vernebelung. Eine 1-Punkt Kalibrierung ist daher nicht einfach anwendbar, auch die üblicherweise verwendete Kontrolle des externen Standards gegen einen zweiten externen Standard ist nicht ohne weiteres möglich. Die quadratische Kalibrierung wird durch Bereiten einer Standard-Stammlösung und anschließendes Verdünnen entsprechender Aliquote erreicht.

Um eine verlässliche Kalibrierkurve zu erhalten, sollten zumindest fünf Kalibrierpunkte ­erstellt werden, idealerweise von einer Konzentration von 70 % bis 130 % der zu erwartenden Konzentration der Probe. Bei einer so gewonnen Kalibrierkurve ist es sicherlich nicht zielführend als einziges Kriterium den Regressionskoeffizienten der quadratischen Trendlinie heranzuziehen.

Dieser kann nur eine Aussage über die Genauigkeit der ­Kalibrierung erlauben. Es sollte eine separate Einwaage eines Standards auf dem zu erwartenden Level der Probe erfolgen.

Die aus der Kalibrierung berechnete Konzentration dieses Standards muss mit der tatsächlichen Konzentration korrelieren und gewisse Akzeptanzkriterien erfüllen, um die Richtigkeit der Kalibrierung zu bestätigen (z. B. 98 % - 102 % Wiederfindung bei einer Bestimmung des Gehalts eines Wirkstoffs auf dem 100 %-Level).

 

Kritische Parameter

Kritische Parameter im Zuge von ELSD Analytik sind Parameter, ­deren Veränderung einen wesentlichen Einfluss auf das Ergebnis der Analytik hat. Die wichtigsten Parameter sind der Stickstoffdruck bzw. die Konstanz dieses Drucks, die Temperatur der Drift Tube und das Abluftmanagement.

 

Druck bzw. Konstanz des Drucks

Der Druck des Verneblungsgases ist von entscheidender Bedeutung bei der Verwendung eines ELSD. Je nach angelegtem Druck erhält man größere oder kleinere Tröpfchen nach dem Verneblungsprozess. Im Zuge von mehreren Methodentwicklungen und auch Validierungen in unserem Labor wurde ein Druck von 4,0 bar als optimaler Druck für das verwendete Gerät (Shimadzu ELSD-LT II) evaluiert, obwohl der Gerätehersteller 3,5 bar empfiehlt.

Bei einem Druck von 4,0 bar erreicht man eine besonders effiziente Verneblung. Abbildung 2 zeigt die Abhängigkeit der Fläche vom Druck. Aus dieser ­Abbildung zeichnet sich die Relevanz der Konstanz dieses Stickstoffdrucks ab. Bei Schwankungen von 0,1 bar hat dies bereits erheblichen Einfluss auf das Analysenergebnis. 3,5 bar wird oftmals als Standarddruck für ELSD - Analytik angegeben, auch in diesem Bereich konnte im Zuge der in Abbildung 2 dargestellten Robustheitsstudie ein wesentlicher Einfluss des Stickstoffdrucks evaluiert werden.

Das heißt, dass nicht nur die Größe des gewählten Drucks eine Rolle in der Analytik spielt, wesentlich wichtiger ist es, diesen Druck konstant bereitzustellen, mit minimal möglichen Schwankungen. Eine entwickelte Analysenmethode bringt keinen Nutzen, wenn das Gasversorgungssystem nicht in der Lage ist, einen konstanten Druck von ± 0,05 bar zu gewährleisten.

Durch den Einbau eines Präzisionsdruckreglers, welcher eine Regelung des Drucks auf ± 0,01 bar erlaubt, kann dieses Problem gelöst werden. ­Dadurch erreicht man eine konstante Zerstäubung des Eluenten im Nebulizer, damit in weiterer Folge eine konstante Partikelgröße von Analytmolekülen nach der Verdampfung des Lösemittels und in weiterer Folge konstante Verhältnisse bei der Detektion.

 

Drift Tube Temperatur

Neben dem Stickstoffdruck spielt auch die Temperatur der Drift Tube für Präzision und Empfindlichkeit eine entscheidende Rolle.

Bei der Analyse ist es wichtig bei Temperaturen so hoch wie nötig, aber so niedrig wie möglich zu arbeiten. Tests mit einem Pestizid als halbflüchtiger Analyt zeigten ein Flächenverhältnis von 5 zu 1 bei 30 °C zu 40 °C Drifttube-Temperatur. Bei der höheren Temperatur verdampft diese Verbindung wesentlich stärker und es bleiben weniger Partikel für die Lichtstreuung zurück. Bei 50 °C konnte lediglich 1/100 des Signals gemessen werden.

Bei thermolabilen Analyten ist besonders auf eine möglichst niedrige Temperatur der Drift Tube zu achten. Abbildung 3 zeigt das Ergebnis einer Robustheitsstudie im Zuge einer Validierung einer HPLC-ELSD Methode zur Quantifizierung einer binären Mischung eines Polypeptidantibiotikums und eines Aminoglykosidantibiotikums. Ein deutlicher Einfluss der Temperatur auf das Analysenergebnis kann Abbildung 3 entnommen werden.

So gilt es also, die Temperatur der Drift-Tube mit Bedacht zu wählen. Grundsätzlich gilt bereits angedachte Regel: So hoch wie nötig, aber so niedrig wie möglich.

 

Abluftmanagement

Auch das Management der Abluft hat einen Einfluss auf das Analysenergebnis. Die Abluft sollte so drucklos wie möglich abgeleitet werden. Ist dies aufgrund der baulichen ­Gegebenheiten nicht möglich, sollte die Abluft mit Hilfe eines geeigneten Abluftsystems möglichst drucklos weggeleitet werden.

Jegliche Sogwirkung auf Abluftseite ist zu vermeiden, eine Wegleitung der Abluft durch ein geeignetes Abluftsystem ist jedoch aus gesundheitlicher und arbeitsrechtlicher Sicht dringend erforderlich. Eine einfache und funktionierende Lösung ist z. B. das Ableiten der Abluft in einen ­Abzug, wobei der Abluftschlauch des ELSD auf keinen Fall direkt mit der Absaugvorrichtung gekoppelt werden sollte.

Optimale Durchmesser und Länge des Abluftschlauchs sind abhängig vom Gerätetyp und von der Art und Weise der Absaugung, weshalb hier keine allgemeine Empfehlung ausgesprochen werden kann. Eine Sogwirkung am Abluftschlauch führt aber zu nicht reproduzierbaren Peakflächen und somit zu hohen ­relativen Standardabweichungen bei Mehrfachinjektionen. Die Präzision des Systems ist nicht gegeben.

 

Zusammenfassung

Der Einsatz eines ELSD stellt ­sowohl an die Anwender als auch an die Infrastruktur hohe Anforderungen. Dies fängt bei der Notwendigkeit einer quadratischen Kalibrierung an und geht bis hin zur Optimierung der Infrastruktur im Laboratorium zur Minimierung der Einflüsse durch die kritischen Parameter.

Werden jedoch die Eigenheiten dieses Detektors beachtet eignet sich der ELSD für Analytik im GMP Umfeld wie z. B. für Freigabeanalytik und Stabilitätsuntersuchungen von Arzneimitteln im Zuge der Qualitätssicherung (Abb. 4 zeigt hierzu Beispiele), wobei der Matrixeinfluss bei Verwendung ­eines ELSD eine wesentlich größere Rolle spielen kann als bei Verwendung eines UV-Detektors.

 

Literatur
[1] Lucena R. et al.: Anal. Bioanal. Chem 388, 1663 (2007)
[2] d. Villiers A. et al.: J. Chromatography A, 1161, 183 (2007)
[3] Charlesworth J.M.: Anal. Chem. 50, 1414 (1987)

 

Kontakt

Christian O.R. Scheidl
Dr. Franz Menzinger
Ernst J. Maier

LPU - Labor für Pharma- und Umweltanalytik
Martinsried
Tel.: 089/899229-0
Fax: 089/8577899
christian.scheidl@lpu-labor.com
franz.menzinger@lpu-labor.com
ernst.maier@lpu-labor.com
www.lpu-labor.com

Prof. Dr. Christian W. Huck
Institut für analytische Chemie
und Radiochemie
Leopold-Franzens-Universität
Innsbruck, Österreich
christian.w.huck@uibk.ac.at

 

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