Vergleich von GPC und Massenspektrometrie

Möglichkeiten und Grenzen der Stabilitätskontrolle von Proteinen

  • Abb. 1: Vergleich Verlauf Retentionszeit, Peak-Höhe (TSKgel/Bio SEC)Abb. 1: Vergleich Verlauf Retentionszeit, Peak-Höhe (TSKgel/Bio SEC)
  • Abb. 1: Vergleich Verlauf Retentionszeit, Peak-Höhe (TSKgel/Bio SEC)
  • Tab. 1: Reproduzierbarkeit Retention / Fläche (TSKgel-/Bio SEC-Säule)
  • Abb. 2: Vergleich der Lagerungsstabilität bei 7 °C, 25 °C, 35 °C mittels a) Bio SEC- b) TSKgel-Säule
  • Abb. 3: Massenspektrum Hämoglobin-Formulierung nach Maximum-Entropie-Dekonvolierung
  • Tab. 2: Wiederfindung Hämoglobin / Ribonuclease A (TSKgel- / Bio SEC-Säule)
  • Tab. 3: Asymmetrie / Peak-Kapazität Hämoglobin / Ribonuclease A (TSKgel- / Bio SEC-Säule) (¹ USP-Tailing, ² Trennstufenhöhe nach Tangenten-Methode)
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Zur chromatographischen Charakterisierung von Proteinformulierungen wird häufig die Gelpermeationschromatographie (GPC) eingesetzt. Die GPC ist einfach in der Anwendung und detektiert höhermolekulare Verunreinigungen (z. B. Aggregate) und niedermolekulare Abbau- Produkte. Hier wird die GPC für die Stabilitätsuntersuchung von Hämoglobin- Präparationen verwendet. Dieser Artikel vergleicht zwei gängige GPC-Säulen und wirft einen Blick auf deren Effizienz durch massenspektrometrische Untersuchungen.

Einführung
Bislang wurde ein auf der TSKgel SuperSW2000 GPC-Säule von Tosoh basierendes, validiertes Verfahren für diese Messungen verwendet. Mit den vorgelegten Messungen soll überprüft werden, ob das Verfahren auf die Bio SEC-3 GPC-Säule von Agilent übertragbar ist und die Messungen gegebenenfalls mit dieser Säule fortgeführt werden können. Diese Phase zeichnet sich nach Herstellerangaben durch ein gecoatetes Silica-Gel aus, das z. B. andere Stabilitäts- Kennzahlen erwarten lässt.

Die Untersuchungen präsentieren einen detaillierten Vergleich hinsichtlich Linearität, Nachweisgrenze, Reproduzierbarkeit, und Selektivität der beiden GPC-Säulen.

Darüber hinaus werden die Resultate mit MS-Untersuchungen verglichen, die eine deutlich höhere Trennleistung / Selektivität aufweisen. Damit soll der Stellenwert (Richtigkeit) der GPC für die Stabilitätsuntersuchungen von Proteinen bewertet werden.

Stabilität der Elution
Die statistische Auswertung der Retention ergab eine gute Reproduzierbarkeit beider Säulen (srel < 0,1 %, vgl. Tab. 1). Es wurde jedoch festgestellt, dass die Retention der Hauptkomponente signifikant steigt, wenn die Konzen tration niedriger wird (von 15,56 min bei 1000 μg / ml auf 16,15 min bei 5 μg/ml). Dies kann z. Zt. nicht erklärt werden. Zur Untersuchung sollten daher Proben mit einer konstanten, niedrigen Konzentration eingesetzt werden.

Für einen detaillierten Vergleich wurden die Retentionszeiten bzw. Peak-Höhen der einzelnen Messungen in Abb. 1 einander grafisch gegenübergestellt. Die Untersuchung der Peak-Flächen der Hauptkomponente ergab bei beiden Säulen keinen signifikanten Trend und wurden deshalb nicht in die grafische Auswertung mit einbezogen.

Die Bio SEC-3-Säule benötigt ebenfalls einige Messungen, um eine konstante Retention bzw.

Peak-Höhe zu erreichen. Der Trend ist jedoch nicht so stark ausgeprägt wie bei der TSKgel SuperSW2000-Säule. Ein Ausreißer während der 9. Messung (15,97 min) mit der Bio SEC-3-Säule wurde im Vergleich nicht berücksichtigt.

Selektivität
Die GPC soll die Bildung von höhermolekularen Oligomeren bzw. von niedermolekularen Abbauprodukten aufzeigen. Zur Bewertung der beiden Systeme wurden dieselben Proben mit beiden Säulen analysiert und verglichen. Die Bio SEC-3-Säule zeigt eine andere Differenzierung des hochmolekularen Anteils. Auch die niedermolekulare Verunreinigung kann in der erwarteten Form nicht detektiert werden.

In Abbildung 2 wird die Registrierung der gleichen Hämoglobin-Charge bei verschiedenen Lagerungs-Bedingungen aufgezeigt, ebenfalls gemessen mit beiden Säulen. Der hochmolekulare Anteil ist bei der Bio SEC-3-Säule nur bei der Lagerung bei 35 °C vom Haupt-Peak zu unterscheiden. Bei den anderen beiden Proben kann der hochmolekulare Anteil nicht eindeutig vom Haupt-Peak differenziert und deshalb nicht wie bislang mit der TSKgel-Säule als prozentualer Anteil der Hauptkomponente ausgewertet werden. Im Gegensatz dazu (Abb. 2b) kann der hochmolekulare Anteil mit der TSKgel SuperSW2000-Säule bei allen 3 Proben explizit ausgewertet werden.

Reproduzierbarkeit
Wesentliche statistische Parameter wurden bei 12 Messungen in Serie ermittelt (Tabelle 1).

Die Resultate der Reproduzierbarkeit zeigen keine großen Unterschiede beider Säulen. Auffällig ist nur der stärker ausgeprägte Trend der TSKgel SuperSW2000, der wie bereits oben beschrieben bei den ersten Messungen auftritt, bevor im weiteren Verlauf eine konstante Elution erreicht wird.

Linearität
Durch Verdünnung einer Standard-Hämoglobinpräparation (1000 μg/ml) wurden 5 weitere Kalibratoren erhalten (5, 10, 50, 100, 500 μg/ml). Zusätzlich wurde die Puffer- Leerinjektion als 0-Kalibrator eingesetzt.

Nach Regression wurde bei der Bio SEC-Säule mittels Varianzanalyse die Gerade als Kalibrationsmodell verworfen, das Polynom 2. Grades für den gesamten Bereich der Kalibration akzeptiert. Im unteren Konzentrationsbereich von 0-10 μg/ml wurde eine Gerade akzeptiert.

Bei der SuperSW-Säule wurde sowohl Gerade als auch Polynom 2. Grades verworfen, nur bei Kalibration im Bereich 10 – 1000 μg / ml (ohne 0-Kalibrator) konnte eine Kalibrationsgerade verwendet werden.

Aus der Kalibration folgt, dass im Bereich 0 bis 100 % der Peak-Fläche kein linearer Zusammenhang mit der Konzentration der Komponenten zugrunde gelegt werden kann, jedoch im Bereich von 0-1 %, weshalb die Nachweisgrenze mittels der Geradengleichung bestimmt werden kann.

Nachweisgrenze
Aus der Registrierung des 1. Kalibrators kann die Nachweisgrenze der Bio SEC-Säule zu 0,5 μg/ml abgeschätzt werden (Signal/ Rauschen = 3:1, Linearität im Bereich < 10 μg/ml konstatiert), bei der SuperSW-Säule ist diese 1μg/ml.

Wiederfindung
Die Wiederfindung wurde mittels 2-dimensionaler HPLC bestimmt. Bei der GPC-Messung 2 verschiedener Proteine wurde die Probe während der Elution des Hauptsignals auf eine Reversed-Phase-Kartusche (heartcut) geleitet und anschließend über eine Reversed- Phase-Chromatography (RPC)-Säule mittels UV-Detektion quantifiziert. Als 100 %-Vergleich diente die direkte RPC-Messung der Protein-Probe. Die beiden Säulen unterscheiden sich bei der Wiederfindung nicht gravierend, die Bio SEC-Säule scheint aufgrund des Coatings eine geringfügig bessere Wiederfindung zu haben.

Trennleistung
Die Trennleistung wurde anhand der Chromatogramme zweier Proteine (Ribonuclease A und Hämoglobin) mit jeweils neuen Säulen ermittelt und in Tabelle 3 dargestellt.

Die Trennstufenhöhen beider Säulen sind vergleichbar, trotz unterschiedlicher Partikelgröße (Bio SEC-3: 3 μm, TSKgel: 4 μm).

Richtigkeit
Alternativ zur GPC wurde für die Stabilitätskontrolle die Massenspektrometrie eingesetzt (ESI-TOF-MS mit online-Entsalzung ohne HPLC-Trennung). Im Massenspektrum (Abb. 3) wird neben den beiden Untereinheiten des Hämoglobin (m/z = 15037,68 und 16033,56) eine weitere Masse im relevanten Bereich detektiert (m/z = 16195,61). Die Konzentration dieser Komponente steigt mit längerer Inkubationszeit, insbesondere bei höheren Temperaturen. Es wird davon ausgegangen, dass hier ein Addukt mit einer niedermolekularen Komponente der pharmazeutischen Formulierung vorliegt.

Diese Komponente konnte mit der GPC nicht detektiert werden. Auch einige Massen im Bereich 2500-5000 m/z (vgl. Masseliste Tab. 4) sind in der GPC nicht zu differenzieren.

Die Richtigkeit der GPC-Analysen zur Proteinstabilität ist daher kritisch zu betrachten.

Schlussfolgerung
Generell muss berücksichtigt werden, dass Signalflächen-Prozentangaben der GPCMessung keinen Rückschluss auf die vorliegenden Konzentrationen erlauben, aufgrund der unterschiedlichen (meist unbekannten) Absorptionskoeffizienten. Die GPC-Analyse zeigt mit der Bio SEC-3-Säule keine deutlichen Unterschiede hinsichtlich Nachweisgrenze und Reproduzierbarkeit. Auch hinsichtlich Linearität und Wiederfindung gibt es keine wesentlichen Unterschiede.

Anders ist dies bei der Selektivität der Elution. Kurz vor bzw. nach dem Haupt- Peak eluieren im Gegensatz zur TSKgel-Säule keine oder kaum auswertbare Komponenten (hoch-, niedermolekular) die als entsprechende Indikatoren für eine Protein-Degradation gut ausgewertet werden könnten. Für diese Aufgabenstellung ist die TSKgel-Säule daher zu bevorzugen.

Unabhängig davon darf nicht außer Acht gelassen werden, dass die Trennleistung der GPC sehr gering ist (Peak-Kapazität ~10). Es kann daher nicht erwartet werden, dass damit alle Protein-Komponenten nach Lagerung erfasst werden. Dies zeigen die MS-Messungen eindrucksvoll. Eine Beurteilung der Proteinstabilität alleine durch GPCUntersuchungen ist daher abzulehnen.

Kontakt
M. Müller
Zentrum Proteinanalyse
FH Bingen
muellermicha@fh-bingen.de

Weitere Beiträge zum Thema GPC: http://bit.ly/GIT-GPC
Mehr Informationen: http://bit.ly/Chromatographie

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