Von der Farbschreibung zur modernen Chromatographie

Ein historischer Überblick

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Fast jeder Vortrag oder jede Publikation zu diesem Thema beginnt mit den Arbeiten von Michail Semjonowitsch Tswett [1]. Sein Experiment bestand darin, dass er ein Glasrohr mit Inulin gefüllt und ein Chlorophyll-Extrakt in Ligroin darauf gegeben hatte. Er goss weiter Ligroin darüber. Zunächst „eluierte“ eine farblose Flüssigkeit, dann wurde ein gelber Ring (Carotin) vor einem grünen Ring am oberen Ende der Säule sichtbar, der sich während des Laufes in einen grünen und einen gelben teilte.

Dieser Versuch wird häufig als die Geburtsstunde der „modernen“ Chromatographie bezeichnet. Dass es vor Tswett aber bereits „Pioniere“ auf dem Gebiet der Chromatographie gegeben hat, deren „Versuche“ bereits in der Bibel dokumentiert sind, kann anhand der umfassenden Ausführungen von Leslie Ettre in seinem Buch „Chapters in the Evolution of Chromatography“ sehr gut nachvollzogen werden [2].

Von der Erfindung zum Einsatz
Wie aber ging es nach der Veröffentlichung von Tswetts Ergebnissen weiter? Tswett hatte lange Zeit damit zu kämpfen, dass seine Technik in Fachkreisen keine Anerkennung fand. Ähnliche Verhaltensweisen sind auch heute noch zu beobachten, wenn eine neue Methode oder ein alternatives Detektionsverfahren entwickelt wird. In erster Linie dominiert die Skepsis und es werden Argumente gesucht, warum eine bestimmte Methode keine Anwendung finden wird. Mit der Zeit setzt sich eine gute Idee irgendwann dann doch zwangsläufig durch. So auch ein paar Jahrzehnte später, als Martin und Synge für ihre Arbeiten zur Verteilungschromatographie 1952 mit dem Nobelpreis geehrt wurden [3-6].
Es dauerte dann wiederum ein Jahrzehnt, bis der Grundstein für die moderne Gerätetechnik gelegt wurde. Jim Waters war der erste, der 1963 einen Chromatographen für die Gelpermeationschromatographie entwickelte. Von diesem Zeitpunkt an hielt die HPLC Einzug in viele Labore, die mit aktuellen Fragestellungen zur Trennung und Aufreinigung von Gemischen beschäftigt waren.

1973 läuteten die Glocken für die HPLC das erste Mal, als im malerischen Interlaken das erste HPLC-Symposium abgehalten wurde [7]. Die Synthese neuer stationärer Phasen sowie eine hohe Reproduzierbarkeit der Trennmedien spielten eine große Rolle bei der Etablierung der Technologie in wichtigen Branchen wie z. B. der chemisch-pharmazeutischen Industrie. Es ist allgemein bekannt, dass ein hoher Aufwand notwendig ist, damit eine Technologie für industrielle Verfahren genutzt werden kann. Bis heute erfreuen sich Umkehrphasen auf Basis von Silikagel großer Beliebtheit. Insbesondere die sehr gute mechanische und auch chemische Beständigkeit dieser Materialien haben neben der hohen Reproduzierbarkeit des Herstellungsverfahrens dazu beigetragen, dass die HPLC schnell zum analytischen Standarderfahren avancierte. Alternative Trennmaterialien wie z. B. poröser grafitisierter Kohlenstoff oder mit Polybutadien beschichtetes Zirkoniumdioxid fristen demgegenüber bis heute ein „Schattendasein“, obwohl die erweiterte pH- und Temperaturstabilität dieser stationären Phasen viele Vorteile bieten.

Kleiner, schneller, besser
Vor diesem Hintergrund hat es bis zum Beginn des neuen Jahrtausends keine wirklichen Neuerungen gegeben. Typische Standarddetektoren wie UV- und Fluoreszenzdetektor waren weit verbreitet und konnten auf einfache Weise mit einem HPLC-System gekoppelt werden. Die Systemvolumina klassischer HPLC-Anlagen waren, verglichen mit dem heutigen Stand der Technik, relativ hoch. Dies war auch der Grund, warum miniaturisierte HPLC-Verfahren in der praktischen Anwendung keine Rolle spielten. Beispielhaft können hier die Arbeiten von Tsuda und Novotny aus dem Jahre 1978 zitiert werden [8]. Um eine Überladung der Kapillarsäulen zu vermeiden, musste der Injektionsstrom geteilt werden. Auf der Detektionsseite musste ein zusätzlicher Hilfsfluss etabliert werden. Hierdurch konnte der negative Einfluss des hohen Volumens der Detektorzelle kompensiert werden, jedoch verringerte sich die Sensitivität. Die Autoren dieser Studie kommen deshalb bereits vor der Ergebnisdiskussion zu der Schlussfolgerung, dass es sich lediglich um Grundlagenuntersuchungen zur Evaluierung der Trennleistung von Kapillarsäulen handelt. Für weitergehende Experimente, und damit auch für eine Routineanwendung, seien bessere Injektionssysteme als auch Detektoren mit geringeren Zellvolumina notwendig.
Obwohl die theoretischen Grundlagen der Chromatographie und damit auch die Vorteile miniaturisierter Trennsysteme mit Etablierung der ersten Geräte also bereits gut dokumentiert waren, hat es seit Einführung des ersten kommerziell verfügbaren HPLC-Systems wiederum vier Jahrzehnte gedauert, bis ein neuer Meilenstein erreicht war. Die durchaus bahnbrechenden Arbeiten der Arbeitsgruppe um Jorgenson haben hierzu den Weg geebnet. In einer Publikation aus dem Jahre 1999 beschreiben die Autoren einen Versuchsaufbau zum Betrieb von Fused-Silka-Kapillaren mit einem Innendurchmesser von 33 µm, die mit nicht porösen Octadecyl-modifizierten Silikagelpartikeln mit einem Durchmesser von 1,0 µm gepackt waren [9]. Das System wurde bei einem Druck von 5.000 bar betrieben, wobei die im Manuskript beschriebene Spritzenpumpe einen Maximaldruck bis zu 9.000 bar aufweist. Bis heute stechen die in verschiedenen Publikationen dieser Arbeitsgruppe beschriebenen Experimente heraus und verdeutlichen das immer noch sehr große Potenzial zur weiteren Verbesserung chromatografischer Systeme.

MS, UHPLC und 1-2-3D
Die kommerzielle Verfügbarkeit von Partikeln mit einem Durchmesser < 2 µm (sog. sub 2 µm Partikel) in Kombination mit einem HPLC-System, dessen Pumpen 1.000 bar generieren konnten und dessen übrige Systembestandteile diesem Systemdruck widerstanden, hat dann erneut zu einer kleinen „Revolution“ im Bereich der analytischen Trenntechnik geführt. Damals löste die Einführung der UHPLC (Ultra high-performance liquid chromatography) in Expertenkreisen nur Kopfschütteln und ein müdes Lächeln aus. Heute haben nahezu alle Firmen, die HPLC-Systeme anbieten, Pumpen mit erweitertem Druckbereich bis 1.000 bar im Produktportfolio. Der Ruf nach besserer chromatografischer Auflösung ging jedoch interessanterweise mit einer Entwicklung im Bereich der Massenspektrometrie einher, die sich teilweise als Konkurrenzmethode zur Chromatographie darstellte.
Mit Einzug der ersten Massenspektrometer in die Routinelaboratorien wurde prognostiziert, dass aufwendige chromatografische Techniken bald der Vergangenheit angehören, denn, so die Argumentation: ein Massenspektrometer kann auch co-eluierende Verbindungen auftrennen. Stimmt! Mit der Zeit stellte sich jedoch heraus, dass auch ein Massenspektrometer ziemlich schnell an seine Grenzen stößt, und zwar immer dann, wenn sowohl die Anzahl an gleichzeitig in die Ionenquelle eingetragener Verbindungen als auch deren Konzentrationsunterschiede sehr groß ist. Schnell wurde deutlich, dass selbst eindimensionale chromatografische Verfahren in Kombination mit der Massenspektrometrie keine ausreichende Trennleistung bieten, wenn z. B. ein verdautes Protein analysiert werden soll. Zweidimensionale Trenntechniken wurden auf wissenschaftlichen Konferenzen plötzlich hoch gehandelt, auch wenn diese noch weit von einer „routinemäßigen“ Anwendung entfernt waren. Heute, im Jahre 2016, bieten bereits mehrere Unternehmen zweidimensionale HPLC-Systeme an, aber die Entwicklung wird keinesfalls stagnieren. Wissenschaftler um Peter Schoenmakers befassen sich damit, dreidimensionale Trennstrukturen auf einem Chip zu entwickeln [10]. Dies mag für viele Anwender extrem futuristisch klingen, der gewaltige technologische Fortschritt wird viele Hürden, die zum gegenwärtigen Zeitpunkt existieren, in absehbarer Zukunft überwinden. Wer dies skeptisch sieht, sollte sich die rasante Entwicklung im Bereich Telekommunikation und Computertechnologie vom Beginn des neuen Jahrtausends bis heute vor Augen führen.

Mikro-LC
Welche Rolle aber spielt hierbei die Mikro-LC? Obwohl die Potenziale sehr vielfältig sind, wird die Technik derzeit nur in geringem Umfang eingesetzt. Dabei sind die Systemvolumina mittlerweile so gering, dass auch Säulen mit einem Innendurchmesser von 300 µm eine vergleichbare Trenneffizienz wie Säulen mit einem Innendurchmesser zwischen 2,1 mm und 4,6 mm aufweisen [11]. Im Bereich der Proteomforschung und Bioanalytik werden Verfahren auf Basis der Nano-LC genutzt, wenn die zur Verfügung stehende Probenmenge limitiert ist. In anderen Applikationsfeldern, in denen genügend Probenmaterial zur Verfügung steht, kommen klassische HPLC oder UHPLC Systeme zum Einsatz. Dass die Mikro-LC hier eine echte Alternative darstellt, haben wir anhand der Validierung einer im eigenen Labor akkreditierten Methode demonstriert. Darüber hinaus ist festzustellen, dass mehr und mehr Hersteller Produkte für den Bereich der Mikro- und Nano-LC anbieten. Die Voraussetzungen zum Einsatz der Mikro-LC sind also denkbar günstig und lassen sich nicht nur auf die bloße Einsparung organischer Lösungsmittel reduzieren, was wir in den kommenden Beiträgen verdeutlichen werden.

Haben Sie Fragen zur Mikro-LC oder zu mehrdimensionalen Trennungen? Das Expertenteam vom IUTA beantwortet sie gerne unter: adlichrom@iuta.de

Autoren: Thorsten Teutenberg, IUTA; Terence Hetzel, IUTA; Juri Leonhardt, IUTA; Denise Löker

Kontakt:
Dr. Thorsten Teutenberg
Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V. (IUTA)
Bereichsleiter Forschungsanalytik
Duisburg
teutenberg@iuta.de

Referenzen:

[1]          M.S. Tswet, 1903.

[2]          L.S. Ettre, J.V. Hinshaw, Chapters in the Evolution of Chromatography, Imperial College Press, 2008.

[3]          A.J.P. Martin, R.L.M. Synge, Biochemical Journal 35 (1941) 1358.

[4]          A.J.P. Martin, R.L.M. Synge, Biochemical Journal 35 (1941) 91.

[5]          A.J.P. Martin, Nobel Lectures - Chemistry 1942-1962, Elsevier, Amsterdam, 1952, p. 372.

[6]          R.L.M. Synge, Nobel Lectures - Chemistry 1942-1962, Elsevier, Amsterdam, 1952, p. 372.

[7]          W. Gehrke , Bayer  Chromatography-A Century of Discovery 1900-2000.The Bridge to The Sciences/Technology, Elsevier Science B.V., Amsterdam, 2001.

[8]          Tsuda, Novotny, Analytical Chemistry 50 (1978) 271.

[9]          J.E. MacNair, K.D. Patel, J.W. Jorgenson, Analytical Chemistry 71 (1999) 700.

[10]        B. Wouters, E. Davydova, S. Wouters, G. Vivo-Truyols, P.J. Schoenmakers, S. Eeltink, Lab on a Chip 15 (2015) 4415.

[11]        T. Hetzel, D. Loeker, T. Teutenberg, T.C. Schmidt, Journal of Separation Science (2016).

 

 

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Microsite Fortschrittliche Chromatographie


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