Zunehmende Miniaturisierung in der Automation

  • Prof. Dr.-Ing. Kerstin Thurow,  Center for Life Science Automation, RostockProf. Dr.-Ing. Kerstin Thurow, Center for Life Science Automation, Rostock
  • Prof. Dr.-Ing. Kerstin Thurow,  Center for Life Science Automation, Rostock
  • Dipl-Ing. Thomas Krüger, Center for Life Science Automation, Rostock
  • Extraktion des Tropfens aus dem Kamerabild
  • Schema der Volumenberechnung
  • Diagramm der Messergebnisse aus Tabelle 2 mit Regressionsgerade

Zunehmende Miniaturisierung in der Automation. Drop-on-Demand Dosiersysteme ermöglichen die Dosierung von Flüssigkeiten im Bereich von wenigen Nanolitern.

Gegenüber den herkömm­lichen Dosiertechniken jedoch besteht eine große Abhängigkeit von den Eigenschaften der verwendeten Flüssigkeiten.

Das Volumen der erzeugten Tropfen ist je nach Flüssigkeit verschieden und die ­Ansteuerung des ­Dosierkopfes muss auf die jeweilige Flüssigkeit ab­gestimmt werden.

Diese Umstände wirken sich problematisch auf den ­Betrieb in einer ­automatisieren Umgebung aus. Für die Bestimmung des Tropfenvolumens in Echtzeit wurde ein geeignetes Verfahren entwickelt, das sich für Drop-on-Demand Nanodosiersysteme einsetzen lässt.

Die zunehmende Miniaturisierung im Bereich der Automation biologischer und chemischer Screeningverfahren führt u. a. auch zur Forderung nach der genauen Dosierung immer kleinerer Volumina unterschiedlichster Lösungen.

Eine geeignete Methode für die Erzeugung sehr ­kleiner Flüssigkeitstropfen zwischen 50 pl und 500 pl ist die Drop-on-Demand-Technologie.

Die Quantelung der abzugebenden Menge erfolgt in der gezielten Erzeugung einzelner Tropfen mit nahezu identischen Eigenschaften. Diese hohe Reproduzierbarkeit ist jedoch nur unter konstanten Bedingungen gegeben. Das Tropfenvolumen hängt von den Dosierparametern, der Flüssigkeit und der verwendeten Nozzle ab.

Die Dosierung von größeren Volumen beruht auf der Abgabe einer definierten Anzahl von Tropfen mit bekanntem Volumen. Somit setzt sich die Dosiermenge aus dem Produkt von Tropfenvolumen und Tropfenanzahl zusammen.

Selbst bei größeren Tropfenzahlen ist die Messung des Volumens aufgrund der geringen Mengen, im Nano- und Mikroliterbereich, eine technische Herausforderung. Für die Anwendung dieser Technologie im Bereich der Laborautomation ist die Frage der Bestimmung des Tropfenvolumens von entscheidender Bedeutung.

Klassische Verfahren der ­Volumenmessung eignen sich nicht für den konkreten Anwendungsfall. Bei den „klassischen" Verfahren ist keine zeitnahe Messung möglich und die notwendigen externen Analysesysteme bedeuten einen materiellen Aufwand und erschweren die Automatisierung der Volumenmessung.

Die Verfahren aus der Partikelmesstechnik eignen sich sowohl für eine sehr präzise Messung des Tropfenvolumens in Echtzeit als auch für die automatische Durchführung.

Es handelt sich jedoch dabei um sehr aufwändige Messtechnik, welche für die Integration in kommer­zielle Geräte unter Umständen einen nicht vertretbaren Aufwand darstellt. [1-3]


Messtechnische Bestimmung des Tropfenvolumens

Grundlage für die Bestimmung des Tropfenvo­lumens ist die Erfassung des Dosiervorgangs. Im Einzelnen sind dabei die Präsenz von Tropfen, eine Positionsbestimmung, der Zeitindex sowie das ­Volumen des Tropfens von Interesse. Die Visualisierung ist bei den meisten Geräten mit Hilfe eines Stroboskop-Kamera Systems um­gesetzt. Die Einspeisung des Kamerabilds in die Dosiersoftware erfolgt in digitalisierter Form. Das Stroboskop ist notwendig, da sich die ­Tropfen zu schnell für eine Einzelnaufnahme mit ­einer gewöhnlichen Kamera ­bewegen. Die ­synchrone Auslösung des Stroboskops mit ­Ansteuerung des Piezokristalls liefert bei kon­tinuierlichem Betrieb ein Bild von sich über­lagernden Tropfen [4].

Mithilfe von Bildverarbeitungsalgorithmen werden aus dem ­erzeugten Bild des Visualisierungssystems die Daten des Tropfens gewonnen. Die eigentliche Bestimmung der Tropfenparameter setzt die optimale Fokussierung des Tropfens voraus. Die Tropfen­bestimmung erfolgt in den folgenden Teilschritten:
Isolation der „Region of Interest": ­Festlegung des Bereiches, in dem nach ­einem Tropfen ­untersucht wird.

Erstellung des Binärbildes: ­bestehend aus den Pixelwerten von 0 für schwarz und 255 für weiß.

Nach der Umwandlung besteht das Bild aus dem ­weißen Hintergrund. Diese ­Konstellation ist jedoch für die ­weiteren Berechnungen ­ungünstig, da der Tropfen
das Objekt von Interesse ist. ­Deshalb erfolgt nach der ­Umwandlung die Bildung des Negativs.

Präparation der Tropfenkontur: Glättung der unscharfen Ränder der Konturen des Binärbildes und Eliminierung einzelner ­störender Pixel über morpho­logische Operationen. Darüber hinaus werden Objekte am Bildrand und ungewollte ­Konturen z. B. resultierend aus ungünstigen Lichtverhältnissen gelöscht, um Messfehler bei ­einem nur teilweise abgebildeten Tropfen zu vermeiden.

Filterung der verbleibenden Konturen: Einzelne Konturen, die nicht den Tropfen darstellen, müssen gefiltert werden. Das Kriterium zur Eliminierung stellt dabei die Fläche der Kontur dar. Gleichzeitig werden die Basisdaten wie Fläche und ­Umfang erfasst.

Projektion der Tropfenerkennung in das Kamerabild: Visualisierung der Bilderkennung im Originalbild für den Benutzer.

 

Berechnung des Tropfen­volumens

Um aus der zweidimensionalen Tropfenkontur einen dreidimensionalen Körper zu berechnen, bestehen mehrere Möglichkeiten. ­Neben anderen möglichen Verfahren wurde die in Abbildung 2 dargestellte Methode verwendet, die von der Annahme einer rotationssymmetrischen Gestalt des Tropfens in Flugrichtung ausgeht.

Volumen eine Scheibe:
Vn = πrn2 · d(Gl. 4.1)
d - Einheitsdicke von 1 Pixel
r - Radius der Scheibe/Breite des Streifens

Volumen des Rotationskörpers der Tropfenhälfte:

VTropfen = Σn  = 1L  Vn = Σn  = 1L πrn2 · d(Gl. 4.2)

d - Einheitsdicke von 1 Pixel
L - Länge des Tropfens
r - Radius der Scheibe/Breite des Streifens

 

Für die Volumenberechnung des Rotationskörpers wird die Kontur in senkrecht zur Symmetrieachse verlaufende Streifen mit der Dicke eines Pixels geschnitten. Aus diesen Streifen erfolgt anschließend die Berechnung von Scheiben gleicher Dicke. Danach werden die ­Volumina der einzelnen Scheiben aufsummiert. Das Resultat dieser Summierung entspricht dem Volumen des Tropfens. Das berechnete Volumen liegt in der Einheit Voxel (Pixel) vor. Für die weitere Verwendung erfolgt die Umwandlung in Pikoliter mithilfe der Kennwerte des optischen Systems [5].

Resultate unterschiedlicher Lösungsmittel

Für die praktische Testung des ­entwickelten Verfahrens wurden Messreihen für Wasser, DMSO und NMP durchgeführt. Die Messungen erfolgten sowohl optisch als auch gravimetrisch. Die Dosierparameter wurden so abgestimmt, dass eine stabile Tropfenbildung erfolgt. Als Dosierfrequenz wurde stets 500 Hz verwendet [6].

Im Ergebnis zeigte sich, dass das gemessene Volumen der Bildverarbeitung größer ist als das der gravimetrischen Bestimmung. Die Ursachen hierfür liegen in der Methode der Visualisierung. Die Stroboskopaufnahme besteht aus sich überlagernden Tropfen, welche sich relativ schnell in der Bildebene bewegen.

Dieser systematische Fehler ist anhängig von der Belichtungszeit, der Bildrate der Kamera und der Frequenz von Tropfenerzeugung. In einem Bereich mit konstanter Beleuchtung und konstanter Dosierfrequenz bleibt der systematische Fehler ebenfalls konstant. Für die verwendete Tropfenfrequenz von 500 Hz mit einer Bildrate von 30 Bildern pro ­Sekunde ist das optisch ermittelte Volumen um den Faktor 1,35 größer; die Mess­unsicherheit beträgt ca. ±8 %.

 

Zusammenfassung und Ausblick

Die demonstrierte Methode zur Volumenmessung kann bei Systemen, die bereits über ein Stroboskop-Kamera System verfügen, durch ein Softwareupgrade implementiert werden. Gegenüber den „klassischen" Verfahren zur Volumenbestimmung ist die Echtzeitfähigkeit der Messung vorteilhaft.

Mit den durch die Bildverarbeitung erfassten Tropfendaten wird außerdem die Grundlage für eine weitere Charakterisierung geschaffen. Damit ist es möglich, eine weitere Bewertung des Tropfenabschusses vorzunehmen und ggf. über eine Rückkopplung zur Aktorik den Tropfen gezielt zu beeinflussen.


Literatur

[1] Porter, G.: American Biotechnology Laboratory 20, 71-72 (2006)
[2] Cooley, P.; Wallace, D.; Antohe, B.: JALA - Journal of the Association for Laboratory Automation 7, 33-39 (2002)
[3] Lemmo, A. V; Rose, D. J.; Tisone, T. C.: Current Opinion in Biotechnology 9, 615 617 (1998)
[4] Dong, H. M.; Carr, W. W.; Morris, J. F.: Review of Scientific Instruments 77, 85-93 (2006)
[5] Awcock, G. J.; Thomas, R.: Applied image processing, McGraw-Hill, 1995
[6] Burgold, J.; Weise, F.; Fischer, M.; Schlingloff, G.; Henkel, T; Albert, J.; Mayer, G.; Schober, A: Macromolecular Rapid Communications 26, 265-280 (2005)

 

Kontakt

Prof. Dr.-Ing. habil. Kerstin Thurow
Dipl.-Ing. Thomas Krüger
celisca - Center for Life Science Automation
Rostock
Tel.: 0381/51964-801
Fax: 0381/51964-803
kerstin.thurow@celisca.de
thomas.krueger@celisca.de

 

Kontaktieren

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.