Bessere analytische Qualität für GPC/SEC-Daten

Wie vertrauenswürdig sind meine Ergebnisse?

  • D.Held, P.Kilz; Qualifizierung von GPC/GFC/SEC-Daten und -Ergebnissen, in: Chromatogramme richtig integrieren und bewerten, S. Kromidas, H.-J. Kuss (eds.), Wiley-VCH, Weinheim, 2008D.Held, P.Kilz; Qualifizierung von GPC/GFC/SEC-Daten und -Ergebnissen, in: Chromatogramme richtig integrieren und bewerten, S. Kromidas, H.-J. Kuss (eds.), Wiley-VCH, Weinheim, 2008
  • D.Held, P.Kilz; Qualifizierung von GPC/GFC/SEC-Daten und -Ergebnissen, in: Chromatogramme richtig integrieren und bewerten, S. Kromidas, H.-J. Kuss (eds.), Wiley-VCH, Weinheim, 2008
  • Abb. 2: Optimierung der Analytische Herausforderung.
  • Abb. 3: Optimale Balance zum Erreichen der Analysenziele.
  • Abb. 4: Definition der analytischen Qualität und Richtigkeit der Ergebnisse.
  • Tab. 1: GPC/SEC Systeme, Analysenziele und Applikationsbeispiele.
  • Tab. 2 Analysendauer, Genauigkeit und Präzision.
  • Tab. 3: Vergleich von Ergebnisunsicherheiten aus verschiedenen Methoden.
  • Tab. 4: Anzahl zusätzlicher Parameter im Vergleich zur konventionellen Datenanalyse für...
  • Abb. 5: Molmassenverteilung und Molmassenmittelwerte mit Messunsicherheit.
  • Abb. 6: AI-Analyse zur Ermittlung der Haupt­ursache für Ergebnisunsicherheit.
  • Abb. 7: Heparinprobe mit Ergebnissen, die formal eine Freigabe erlauben aber fragwürdig sind.
  • Abb. 8: Vergleich der Messunsicherheit für eine Check-out-Probe unter Verwendung verschiedener Kalibrieroptionen.

GPC/SEC ist die Standard-Trenntechnik in allen Laboratorien, die mit klassischen Polymermaterialien, mit Produkten für die Bau- und Elektroindustrie, mit pharmazeutischen Hilfsstoffen oder Biotherapeutika, mit Nährstoffkolloiden (Hydrokolloiden) und vielem mehr arbeiten.

Die Erfolgsgeschichte hat viele Gründe

  • Mit Hilfe der mit dieser Methodik erhaltenen Ergebnisse lassen sich Produkteigenschaften und Anwendungsverhalten direkt aus dem Chromatographielabor heraus vorhersagen.
  • Sie ist eine sehr vielseitige Technik mit Anwendungen in Forschung und Entwicklung, Qualitätssicherung und (online, atline) Produktionskontrolle.
  • Sie ist eine ausgereifte, zuverlässig und robust funktionierende Trenntechnik.
  • Die jeweiligen Geräte- und Softwarelösungen sind voll skalierbar. Einfache Systeme können mit Spezialdetektoren aufgerüstet werden und in einer Makromolekularen Chromatographie Datensystem (MCDS)-Umgebung organisiert und verwaltet werden.
  • Sie ist perfekt für regulierte Labors in der Pharma-, Lebensmittel- und Kosmetikindustrie geeignet. Etablierte Partner bieten optimierte Hardware, Software, IQ/OQ-Services und erfahrene Servicetechniker, um den gesamten Systemlebenszyklus abzudecken.

Abbildung 1 zeigt die einfachste Ausführung eines GPC/SEC-Systems. Tabelle 1 listet typische Systeme mit ihren Anwendungsbereichen.

Herausforderungen bezüglich der analytischen Qualität

Die Entwicklungen der letzten Jahre haben dazu geführt, dass Laborprozesse sich grundlegend geändert haben. Immer komplexere Methoden und Geräte müssen  von demselben, in vielen Fällen sogar weniger, Personal betreut werden. Das fällt zusammen mit ständig steigenden Probenzahlen und einem erhöhten Dokumentationsaufwand. Als Reaktion darauf ist der Bedarf an schnellen Methoden und Laborautomatisierung zum Erhalt von mehr Ergebnissen in kürzerer Zeit stetig gestiegen. Der Mangel an Personal und, noch wichtiger, der Mangel an spezifischen Methodenexperten in den Labors, ist dabei jedoch eine ständige Bedrohung der Qualität von Analysenergebnissen. Dieses Dilemma ist visualisiert in Abbildung 2, die die treibenden Kräfte im Labor in Beziehung setzt.

Offensichtlich benötigt man für jede Applikation den optimalen Punkt zwischen Analysendauer, Investitionen in Infrastruktur, Personal und Schulung und der Qualität der Ergebnisse.

Dieser ist abhängig von dem Einsatzbereich des Produktes und muss entsprechend angepasst werden. Aufgabe des Laborleiters ist es festzulegen, welche analytische Mindestqualität erforderlich ist und den benötigten Ressourceneinsatz entsprechend anzupassen. Diese Optimierung kann durch Iteration der Aufwands-/Qualitätsbeziehung, wie in Abbildung 3 dargestellt, ermittelt werden.

Die Rolle von Software für die analytische Qualität

Valide GPC/SEC-Ergebnisse sind in vielen Anwendungen von entscheidender Bedeutung. Beispielswiese müssen Heparin, Dextran oder Hydroxyethylstärke für die Notfallversorgung sehr enge QC/QA-Test-Spezifikationen erfüllen. Ebenso wichtig sind Ergebnisse für die Registrierung von Polymerprodukten oder -formulierungen bei Aufsichtsbehörden wie der FDA, der ECHA und anderen. Mittels GPC/SEC-Daten werden Toxizität beurteilt und die sichere Verwendung von Produkten belegt. Offensichtlich sind die Genauigkeit und Präzision der GPC/SEC-Ergebnisse in einem solchen Kontext ein wichtiges Thema. Aussagekräftige chromatographische Ergebnisse hängen von der strengen Wiederholbarkeit der Trennbedingungen und der Systemperformance ab. Der GPC/SEC-Trennprozess wird, genau wie bei anderen Flüssigchromatographie-Verfahren auch, von mehreren Parametern beeinflusst. Dies ist einer der Gründe für die vielfältigen Einsatzmöglichkeiten. Daraus resultiert aber auch der Nachteil, dass ein gutes Methodenverständnis und die Einhaltung detaillierter Laborrichtlinien durch die Benutzer notwendige Vorrausetzungen sind. Zusätzliche Parameter beeinflussen die Gültigkeit und Genauigkeit der Ergebnisse, da die Instrumentierung eine weitere Komplexitätsebene hinzufügt und auch deren Parameter überwacht werden müssen.

Jeder Chromatographieanwender weiß aus eigener Erfahrung, dass viele experimentelle Details das Ergebnis und die endgültige analytische Qualität eines Experiments beeinflussen können [1]. Es gilt hier zu unterscheiden zwischen systematischen und zufälligen Beiträgen. Eine gute analytische Qualität wird nur erreicht, wenn systematische und zufällige Fehler vermieden werden (Abb. 4).

Systematische Fehler können durch ausreichende Schulung und Zeit, die Analysen gut und sicher durchführen zu können, minimiert werden. Dagegen sind zufällige Fehler schwieriger zu identifizieren und zu belegen. Typische Beiträge zu statistischen (zufälligen) Fehlern sind unter anderem:

  • Druckschwankung (Pumpe)
  • Alte (rauschige) UV-Lampe
  • Nicht-equilibrierter RI-Detektor
  • Säulenbluten
  • Unzureichende Entgasung des Laufmittels
  • Schlechte Kalibrierqualität
  • Schlechte Normalisierung des Malls (multi angle laser light scattering)-Detektors
  • Stabilität der Viskositätsdaten
  • Genauigkeit der Lichtstreudaten

Statistische Modelle sind gut geeignet, um zufällige Ergebnisabweichungen vom wahren (oder allgemein akzeptierten) Wert zu quantifizieren [2]. Wenn also zufällige Fehler überwacht werden, kann eine Messunsicherheit bestimmt werden. Die Hauptbeiträge zur Messunsicherheit in der GPC/SEC resultieren aus Detektorsignalqualität, der Qualität der Kalibration und der Systemstabilität. Erweiterte Fehlerfortpflanzungsrechnungen müssen durchgeführt werden, um eine zuverlässige Aussage zur Endergebnismessunsicherheit zu erhalten [3].

Moderne Chromatographiesoftware kann zur Überwachung der Einflussgrößen, zur Berechnung und Bewertung von Mess­unsicherheiten auf der Grundlage der Feh-lerfortpflanzung verwendet werden. Anwender können diese Funktionalität nutzen, um potenzielle Fehlerquellen zu identifizieren bevor ein Ergebnis in einen Bericht eingeht. Angaben zur Messunsicherheit werden deshalb in vielen Applikationen gefordert und gehören zu den Standardfragen beim Eta-blieren einer neuen Methode. Bis heute gibt es jedoch nur eine einzige Chromatographiesoftware [4], mit der die statistischen Fehler für alle typischen GPC/SEC-Ergebnisse unabhängig von den verwendeten Geräten im Labor vollautomatisch ermittelt und angegeben werden können.

Die Bestimmung von Messunsicherheiten in WinGPC erfolgt für alle Molmassenmittelwerte, Molmassenfraktionen (z. B. <500 Da, benötigt für  Toxizitätsbewertung in FDA-Zulassungen und Reach-Registrierungen), Peakflächen, Peakpositionen, Viskositäten, Radien und Mark-Houwink-Konstanten. Unterstützt werden alle Kalibrierverfahren von konventioneller, breiter, universeller Kalibration bis zu Endgruppen-, Viskositäts- oder Lichtstreudetektion.

Abbildung 5 zeigt Ergebnisse aus der Molmassenverteilung mit aktivierter Messunsicherheitsausgabe. Die Ergebnistabelle zeigt die Ergebnisse für verschiedene Parameter zusammen mit der jeweiligen relativen Ergebnisunsicherheit in % in Spalte drei. Zusätzliche Detektorsignale werden entsprechend in weiteren Spalten dargestellt.

In diesem Beispiel hat die gewichtsmittlere Molmasse (Mw) einen Wert von 4390 Da mit einer Messunsicherheit von 3,84%. Die daraus resultierende Messunsicherheit der Molmasse beträgt somit 168 Da. Folglich liegt der wahre Mw-Wert für diese Probe zwischen 4222 Da und 4558 Da mit einem Konfidenzniveau von etwa 70 %. Um eine Zuverlässigkeit von 95 % für ein Ergebnis zu erzielen, muss der Fehler mit zwei multipliziert werden, was bedeutet, dass das wahre Gewichtsmittel der Molmasse zwischen 4054 Da und 4726 Da liegt. Diese Ergebnisunsicherheiten bedeuten auch, dass die Ergebnisse unabhängiger Experimente mit einer Gültigkeit von 95 % nicht als unterschiedlich angesehen werden können, wenn die einzelnen Ergebnisse innerhalb der Vertrauensgrenzen von 4054 Da und 4726 Da liegen.

Möchten Anwender die Ergebnisqualität verbessern, bietet die Artificial Intelligenz (AI) Engine der genannten Software (Abb. 6) eine detailierte Analyse an. Sie erstellt eine übersichtliche Bewertung der Beiträge zur Mess-unsicherheit, in der empfohlen wird, welche Aspekte der Analyse verbessert werden sollten. Die Analyse für das Beispiel in Abbildung 5 zeigt dass die Qualität des Detektorsignals den Hauptbeitrag zu den statistischen Fehlern der (schon relativ geringen) Messunsicherheit liefert. Die Kalibrierqualität und die Stabilität des Systems spielen für diese Injektion fast keine Rolle.

Offensichtlich gibt es eine Vielzahl von GPC/SEC-Methoden, die von der Bewertung der Ergebnisunsicherheit profitieren. Abbildung 7 zeigt Ergebnisse eines Heparin-Freigabetests, die eigentlich belegen, dass die numerischen Ergebnisse (Gewichtsmittel und Fraktionen mit hoher und niedriger Molmasse) den erforderlichen Produktspezifikationen entsprechen. Die Messunsicherheit (vgl. Spalte drei) ist jedoch so groß, dass das Produkt auch außerhalb der Spezifikationen liegen könnte, so dass diese Charge im Einsatz beim Patienten versagen könnte. Die AI-Engine der MCDS-Software benennt als Hauptursache in diesem Fall die schlechte Qualität der verwendeten Kalibration (schlecht gewählte Fitfunktion).

Genauigkeit und Präzision mit Lichtstreu- oder Viskosimeter-Detektion

Je komplexer GPC/SEC-Systeme werden, desto wichtiger sind Metriken, die es den Anwendern erlauben, die Auswirkungen auf die Ergebnisse verstehen zu können. Multi-Detektor-Systeme mit Malls und Viskosimeter werden mittlerweile sehr häufig eingesetzt, aber ihre Auswirkungen auf die Genauigkeit und Präzision der Ergebnisse wurden oft nicht entsprechend berücksichtigt. Das wichtige Verständnis des Einflusses systematischer und zufälliger Fehler auf das Ergebnis von Lichtstreu- und/oder Viskosimeterdaten wird im Folgenden erörtert.

Abbildung 8 zeigt die GPC/SEC-Ergebnisse, die mit einem Triple-plus-Detektionsaufbau mit Malls- und Viskositätsdetektoren erhalten wurden. Eingesetzte Konzentrationsdetektoren waren ein UV-Detektor sowie ein Brechungsindexdetektor, RI. Die Messunsicherheit für alle Parameter ist gering und entspricht den Erwartungen (Spalten sechs und sieben in Tab. 3).

Werden die Messunsicherheiten desselben Chromatographielaufs mit dem identischen Rohdatensatz mit Verwendung der Rohdaten für LS und Viskosität verglichen, stellt man fest, dass die Ergebnisse mit herkömmlicher Standardkalibration (engverteilte Referenzmaterialien) signifikant geringere Messunsicherheiten aufweisen (Tabelle 3, Spalten drei und fünf mit sechs und sieben). Der Grund für die größeren statistischen Fehler bei der Viskosität (ca. Faktor zwei) und insbesondere bei der Lichtstreuung (ca. Faktor vier bis sechs) wird durch zusätzliche Signale (z. B. 18 Winkel für Malls) und der zu berücksichtigenden Parameter verursacht. Daraus folgt, dass die höchste Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit für GPC/SEC-Methoden gegeben ist, die den am wenigsten komplexen Aufbau haben. Von der Molmasse unabhängige Ergebnisse, wie z. B. Peakposition Vp und Peakfläche A, unterliegen keinen zusätzlichen Berechnungen und zeigen somit im Vergleich zum RI-Ergebnis die gleichen Ergebnisse und dieselbe Messunsicherheit.

Obwohl es, wie oben gezeigt, eine höhere Messunsicherheit für Ergebnisse gibt, die mit Lichtstreuung und Viskosimetrie erhalten werden, sollte die Signifikanz dieser Methoden nicht unterschätzt werden. GPC/SEC ist eine Relativmethode, die basierend auf dem hydrodynamischen Volumen eines Moleküls in Lösung trennt und eine Kalibrierung erfordert. Genaue Ergebnisse können nur erzielt werden, wenn die Proben und Kalibriersubstanzen chemisch und strukturell zumindest vergleichbar (besser noch identisch) sind. Lichtstreu- und Viskositätsdetektoren können diesen Nachteil der GPC/SEC ausgleichen. Wichtig ist es jedoch bei der Auswahl eines Systems immer die Anwendung im Blick zu haben und in Hinsicht auf diese festzulegen welche Ansprüche bezüglich der analytischen Qualität die Dominierenden sind.

Zusammenfassung

Jede Analysemethode hat ihre eigene Mess­unsicherheit. Um die Ergebnisse richtig interpretieren zu können, ist es wichtig, die Präzision und Genauigkeit einer Analysemethode zu hinterfragen. Durch die Bestimmung der Messunsicherheit wird die analytische Qualität erheblich verbessert, da zumindest die statistischen Fehler berücksichtigt werden können. Das führt zu einer deutlich erhöhten Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Messungen und die Beurteilung ob Proben innerhalb der Messunsicherheit gleich oder verschieden sind wird deutlich einfacher. GPC/SEC-Software kann die Messunsicherheit berechnen und dem Anwender somit diese Arbeit abnehmen.

 

Autor
​Peter Kilz

 

Kontakt   
Peter Kilz

PSS Polymer Standards Service GmbH,
Mainz, Deutschland
PKilz@pss-polymer.com

 

Online-Seminar zu GPC/SEC/GFC

 

Literatur

1) a) D.Held, P.Kilz; Qualifizierung von GPC/GFC/SEC-Daten und -Ergebnissen, in: Chromatogramme richtig integrieren und bewerten, S. Kromidas, H.-J. Kuss (eds.), Wiley-VCH, Weinheim, 2008

b) ISO Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement, International Organisation for Standardisation, Geneva, 1995

c) ISO 5725: Accuracy of measurement methods and results, Geneva, 1997

d) S. Ellison, M. Rosslein, A. Williams, (eds.), EURACHEM/CITAC Guide: Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, London, 1995

e) A. Williams, S. Ellison (eds.), EURACHEM/CITAC Guide: Use of Uncertainty Information in Compliance Assessment, London, 2007

f) S. Ellison, M. Rosslein, A. Williams, (eds.), EURACHEM/CITAC Guide: Traceability in Chemical Measurement, London, 2003

2) P.R. Bevington, D.K. Robinson; Data Reduction and Error Analysis for the Physical Science, Mc.Graw-Hill, New York, 1992

3) B.P. Roe; Probability and Statistics in Experimental Physics, Springer, Berlin, 1992

4) PSS WinGPC UniChrom MCDS Benutzerdokumentation, PSS Polymer Standards Service, Mainz, 2009 

 

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PSS Polymer Standards Service GmbH


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