Intelligente Peakdekonvolution

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  • Abb. 1: Strukturformeln der Methylacetophenone.Abb. 1: Strukturformeln der Methylacetophenone.
  • Abb. 1: Strukturformeln der Methylacetophenone.
  • Abb. 2: Einzelchromatogramme und individuelle Spektren der Methylacetophenon-Standards.
  • Abb. 3: Chromatogramm der Trennung eines Methylacetophenon-Gemischs; Verhältnis o-MAP: m-MAP:p-MAP 100:1:100.
  • Abb. 4: Zugesetzte Verunreingung zu p-Methylacetophenon-Standard und deren Gehaltsbestimmung.
  • Tab. 1: Analytische Trennbedingungen (HPLC).
  • Tab. 2: Evaluation der Peakdekonvolution für die quantitative Bestimmung von Methylacetophenonen.

 

Gerade bei der Analyse komplexer Proben mittels HPLC treten oftmals mehrere kritische Peakpaare auf und es kommt zur Koelution. Für eine Basislinientrennung ist dann eine langwierige Methodenoptimierung notwendig. Als Alternative kann die mathematische Trennung von Peaks per Dekonvolution eingesetzt werden. Dies ist eine neue und verlässliche Funktion moderner Laborsoftware zur Identifizierung und sogar Quantifizierung koeluierender Substanzen.
 
 
Gerade bei komplexen Proben stößt die Chromatographie oft an ihre Grenzen. Die Folge sind koeluierende Substanzen, die sich im Bestfall durch eine aufwendige und zeitintensive Methodenoptimierung auftrennen lassen. In manchen Fällen ist jedoch eine Basislinientrennung von kritischen Peakpaaren selbst mit zahlreichen Optimierungsansätzen nicht oder nicht vollständig zu erreichen.
Ein Ansatzpunkt, diese Problematik zu lösen, kann Peakdekonvolution sein. Über verschiedene Berechnungen lassen sich dabei die Peaks von koeluierenden Substanzen mathematisch voneinander trennen und in Einzelspektren darstellen. Die Voraussetzung dafür sind hinreichend unterschiedliche Spektren der Einzelsubstanzen, die Aufnahme dieser Spektren mittels Photodiodenarray-Detektor und die entsprechende Funktion in der Software zur Auswertung der Chromatographiedaten.
Mit der Peakdekonvolution ist es möglich zu bestimmen, wie groß der tatsächliche Anteil der Überlappung von Peaks ist.
So lässt sich beispielsweise in der präparativen Aufreinigung klären, ob für Spurenstoffe eine weitere Methodenoptimierung notwendig ist oder die Verunreinigungen nur einen sehr geringen Anteil des Hauptpeaks ausmachen. Bei komplexen Proben mit mehreren kritischen Peakpaaren können durch Dekonvolution Quantifizierungen angestellt werden, selbst wenn nicht alle Verbindungen basisliniengetrennt werden konnten.
 
Peakdekonvolution in moderner Laborsoftware
 
Die Berechnungen zur Peakdekonvolution können externe Kalkulationsprogramme oder in der Auswertesoftware enthaltene Anwendungen übernehmen. Hier wird die Funktionsweise eines solchen Programmes erläutert.
Der Algorithmus der Funktion basiert auf der MCR-ALS-Technik (multivariate curve resolution alternating least squares).

Nach der Auswahl der betroffenen Peaks durch Angabe der Wellenlängen- und Zeitbereiche werden die verschiedenen Komponenten rechnerisch in einzelne Ab-sorptionsspektren und Chromatogramme aufgetrennt. Sind beispielsweise keine Einzelstandards verfügbar, kann die Dekonvolution in Einzelsubstanzen zusätzlich dazu verwendet werden, Spektren zu identifizieren und Peaks zu quantifizieren. Die Trennung von Peaks ist dabei auch auf koeluierende Isomere anzuwenden, sofern diese ausreichende spektrale Unterschiede aufweisen.

Beispielhaft wird im Folgenden die Trennung der drei Stellungsisomere von Methylacetophenon gezeigt. Die Struktur der drei Isomere o-Methyacetophenon (o-MAP), m-Methylacetophenon (m-MAP) und p-Acetophenon (p-MAP) sind in Abbildung 1 dargestellt. Aus der Analyse der Einzelstandards mit den in Tabelle 1 angegebenen Bedingungen ergeben sich die Chromatogramme und Spektren aus Abbildung 2.

 

Spektrale und quantitative Analyse
Die Zuordnung und Identifizierung von Einzelsubstanzen ist eine vergleichsweise triviale Aufgabe. Werden die Analysen jedoch komplexer, erschwert sich eine sichere Zuordnung und Quantifizierung von Peaks. Vermischt man die drei Isomere im Verhältnis o-MAP:m-MAP:p-MAP 100:1:100, ist bei den gleichen Trennbedingungen keine Basislinientrennung mehr zu erreichen (Abb. 3). Besonders in der Vergrößerung ist zu erkennen, dass durch die Elution des p-MAP genau zwischen den beiden anderen Isomeren eine scheinbare Peaküberlappung entsteht, die bei der bloßen Betrachtung des Chromatogramms nicht eindeutig identifiziert werden kann.
An dieser kann die Peakdekonvolution Aufschluss darüber geben, ob es sich ausschließlich um zwei überlappende Peaks oder eine weitere Verunreinigung unter der Peakkurve handelt. In Abbildung 3 sind die drei Peaks des hier vorgestellten Beispiels gezeigt, die durch Berechnung im festgelegten Zeit- und Wellenlängenbereich (5-7 min, 210-320 nm) aufgetrennt werden können.
 
Bestimmung von Verunreinigungen
In einem weiteren Beispiel wurde p-MAP eine Verunreinigung zugesetzt. Im Original-Chromatogramm zeigt sich diese lediglich durch ein schwaches Tailing des Hauptpeaks (Abb. 4, links). Auch hier wurde wieder die genannte Funktion zur Dekonvolution der Verunreinigung vom Hauptpeak eingesetzt, um zwei unabhängige Einzelpeaks zu erzeugen. Auf diese Weise kann für den Peak der mathematisch isolierten Verunreinigung ein Spektrenabgleich gegen Datenbanken erfolgen.
Im vorliegenden Fall konnte dabei m-MAP mit einer Ähnlichkeit von 0,9990 identifiziert werden. Trennt man das Gemisch zur weiteren Absicherung auf einer geringfügig anderen Säule auf, kann man das m-MAP deutlicher vom Hauptpeak unterscheiden (Abb. 4, rechts). Die Flächenverhältnisse nach Lotfällung ergeben nach Dreifachfachbestimmung einen m-MAP-Gehalt von 2,15 %.
 
Quantitative Bestimmung über Dekonvolution
Die Dekonvolution kann allerdings nicht nur zur Identifizierung, sondern auch zur Quantifizierung koeluierender Verbindungen eingesetzt werden. Als Beispiel wurde ein Gemisch aus den Methylacetophenonen vermessen und quantifiziert. Die Konzentrationen von o-MAP und m-MAP betrugen jeweils 400 μg L-1, das p-MAP lag mit nur 4 μg L-1 in der Mischung vor. Die koeluierenden Peaks wurden wieder mit Hilfe der beschriebenen Funktion in Einzelpeaks isoliert.
Vergleicht man jetzt die Ergebnisse der Dekonvolution mit der von Einzelmessungen, zeigt sich eine starke Übereinstimmung (Tab. 2). Der Fehler nach Dreifachbestimmung zwischen dem wahren und dem berechneten Wert beträgt bei den hochkonzentrierten Komponenten unter 0,5 %. Für das niedrig konzentrierte p-MAP ist er erwartungsgemäß etwas höher, aber auch hier kann eine sehr hohe Übereinstimmung beim Spektrenabgleich erzielt werden.
 
Fazit
 
Die Dekonvolution ist eine wirkungsvolle Technik, um bei schwierigen Proben koeluierende Verbindungen zuverlässig mathematisch voneinander zu trennen. Durch den Einsatz eines Photodionenarraydetektors und die passende chromatographische Auswertesoftware kann die Dekonvolution durch einfache Angabe von Zeit- und Wellenlängenbereich automatisiert ausgeführt werden.
 
Solche Funktionen wie die im Artikel vorgestellten helfen, Proben schneller zu analysieren und die Produktivität im Labor zu erhöhen. Auch für die Analyse von Isomeren können sie genutzt werden. Proben können so auch weit nach der Messung weiter analysiert werden und die Zielverbindungen oder Verunreinigungen in der Datenauswertung identifiziert, ihre Spektren abgeglichen und ihr Gehalt bestimmt werden.
 
 
​Autor:
 
Dr. Isabelle Spenner
 
 
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Dr. Isabelle Spenner
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