Alzheimersche Demenz

A-Oligomer-gerichtete Diagnose und Therapie

  • Abb. 1: Schema eines Spiegelbild-Phagendisplays. Zunächst wird das genaue Spiegelbild des Ziel-Moleküls synthetisiert. Im Falle von Proteinen ist dies ein Peptid mit der gleichen Aminosäuresequenz wie das Original-Protein, aber anstatt L-enantiomeren Aminosäuren werden D-enantiomere Aminosäuren als Bausteine verwendet. Mit diesem „D-Target“ wird eine Phagendisplay-Selektion durchgeführt, um ein L-Peptid zu identifizieren, das an das D-Target bindet. Spiegelt man diesen Komplex, erhält man wieder das Original L-Target und ein D-Peptid, das daran bindet. D-enantiomere Peptide sind im Gegensatz zu L-Peptiden extrem stabil und wenig oder gar nicht immunogen.Abb. 1: Schema eines Spiegelbild-Phagendisplays. Zunächst wird das genaue Spiegelbild des Ziel-Moleküls synthetisiert. Im Falle von Proteinen ist dies ein Peptid mit der gleichen Aminosäuresequenz wie das Original-Protein, aber anstatt L-enantiomeren Aminosäuren werden D-enantiomere Aminosäuren als Bausteine verwendet. Mit diesem „D-Target“ wird eine Phagendisplay-Selektion durchgeführt, um ein L-Peptid zu identifizieren, das an das D-Target bindet. Spiegelt man diesen Komplex, erhält man wieder das Original L-Target und ein D-Peptid, das daran bindet. D-enantiomere Peptide sind im Gegensatz zu L-Peptiden extrem stabil und wenig oder gar nicht immunogen.
  • Abb. 1: Schema eines Spiegelbild-Phagendisplays. Zunächst wird das genaue Spiegelbild des Ziel-Moleküls synthetisiert. Im Falle von Proteinen ist dies ein Peptid mit der gleichen Aminosäuresequenz wie das Original-Protein, aber anstatt L-enantiomeren Aminosäuren werden D-enantiomere Aminosäuren als Bausteine verwendet. Mit diesem „D-Target“ wird eine Phagendisplay-Selektion durchgeführt, um ein L-Peptid zu identifizieren, das an das D-Target bindet. Spiegelt man diesen Komplex, erhält man wieder das Original L-Target und ein D-Peptid, das daran bindet. D-enantiomere Peptide sind im Gegensatz zu L-Peptiden extrem stabil und wenig oder gar nicht immunogen.
  • Abb. 2: Schema einer therapeutischen Strategie, die nicht auf A-Monomere oder unspezifisch auf alle möglichen A-Spezies zielt, sondern hochspezifisch die besonders toxischen A-Oligomere adressiert.
  • Abb. 3: Prinzip des sFIDA-assays. A: Auf einer Glasoberfläche (grau) werden Anti-Aβ-Antikörper immobilisiert (Y-förmige Icons). Wird nun eine Probe aufgebracht, die Aggregate aus Aβ-Molekülen (orange Stäbchen) enthält, werden diese durch die Antikörper „gefangen“. Durch die Zugabe von Anti-Aβ-Antikörpern, die mit Floureszenzfarbstoffen (rot und grün) markiert sind, werden diese Aβ-Aggregate entsprechend markiert. Fährt man die Oberfläche durch einen Laser-Fokus ab, wird jedes Aβ-Aggregat im roten und im grünen Detektionskanal gleichzeitig eine Fluoreszenz-Intensitäts-Spitze auslösen (rechte Bilder-Spalte). B: Enthält die Probe jedoch nur Aβ-Monomere, werden keine hohen Fluoreszenz-Intensitäts-Spitzen erzeugt. Erkennen Fänger- und Detektionsantikörper identische oder überlappende Epitope, können Fluoreszenz-Intensitäts-Spitzen völlig unterdrückt werden. Die rechte Bilderspalte zeigt das Ergebnis einer Probe, die die gleiche Gesamt-Aβ-Konzentration wie in A enthält, aber ausschließlich in Form von Monomeren vorliegt. Der sFIDA-Assay ist also extrem sensitiv (Einzelaggregat-sensitiv) für Aβ-Aggregate (A) und unempfindlich für Aβ-Monomere (B).

Alzheimersche Demenz (AD) ist eine neurodegenerative Erkrankung und stellt mit weltweit 24 Millionen Betroffenen die am meisten verbreitete Demenzform dar. Alleine in Deutschland leiden mehr als eine Million Menschen an „Alzheimer" und verursachen Kosten von mehr als 30 Mrd. € pro Jahr. Dies alles kommt zum Leid der Betroffenen und deren Angehörigen hinzu. Da der größte Risikofaktor für AD das Alter ist, rechnet man bis 2030 mit einem weltweiten Anstieg auf 44 Millionen AD-Patienten [1].

Die pathologischen Merkmale von AD sind neurofibrilläre Bündel aus hyperphosphoryliertem Tau-Protein, Amyloidplaques oder kurz Plaques, die aus dem Amyloid--Peptid (A), bestehen [2] und Neurodegeneration, also der Verlust von Nervenzellen und Synapsen. In den letzten 25 Jahren standen deshalb Tau und besonders das A-Peptid im Verdacht AD auszulösen, weshalb Therapie-Strategien entwickelt wurden, die sich gegen dieses Peptid als solches richteten.

Bis heute gibt es keine kausale Therapie der AD. Die derzeit auf dem Markt befindlichen Medikamente können lediglich für begrenzte Zeit Symptome der AD leicht abschwächen, aber den Verlauf der Krankheit weder aufhalten noch umkehren. Nach heutigem Kenntnisstand ist der entstehende Schaden im Gehirn irreversibel. Zudem beginnt die Pathogenese der AD mindestens 20 Jahre vor dem Eintreten der ersten Symptome. Somit ist es von größter Dringlichkeit einen Wirkstoff zu entwickeln, der eine kausale Therapie der AD ermöglicht, und damit den Krankheitsverlauf stoppen oder zumindest entscheidend verlangsamen kann. Dafür sind auch neue Biomarker-basierte Verfahren für eine frühere und sichere Diagnose von „Alzheimer" erforderlich.

Die wichtigsten Fakten zur AD

  • Als Auslöser der AD stehen Aggregate des Amyloid--Peptids (A) im Verdacht.

  • Monomeres A entsteht während unseres ganzen Lebens ständig in unserem Körper durch sequentielle Proteolyse des Vorläuferproteins APP (Amyloid-Precursor-Protein) durch - und -Sekretasen [3] und ist nicht toxisch. Es wird diskutiert, dass monomeres A eine physiologische, vielleicht sogar neuroprotektive Funktion im Gehirn besitzt [4].

  • A entsteht in mehreren Varianten.

    Je nach Prozessierung entstehen aus dem APP A(1-40), A(1-42) oder andere Teilstücke. Einige werden weiter prozessiert. Unter anderem entstehen so N-terminal verkürzte Versionen, z. B. A(3-40), das dann zum Teil pyro-Glutamat-modifiziert wird: pE-A(3-40) [5]. Die verschiedenen A-Versionen besitzen unterschiedliche Aggregationsneigungen.

  • Es wird angenommen, dass sich A-Monomere abhängig von ihrer Konzentration, zufällig und damit mit zunehmendem Lebensalter immer wahrscheinlicher spontan mit ihresgleichen aggregieren und dabei A-Oligomere und große Fibrillen bilden [6,7]. Die großen A-Fibrillen findet man post mortem in Form von Ablagerungen (Plaques) im Gehirn der betroffenen Patienten.

  • Besonders die kleinen diffundierbaren A-Aggregate, sogenannte „Oligomere" stehen im Verdacht, eine stark toxische Wirkung auf Nervenzellen (Neuronen) zu haben und diese irreversibel zu schädigen, wodurch die Zahl der Neuronen und besonders die Verbindungen zwischen ihnen (Synapsen) drastisch reduziert werden [8]. Diese neuro-toxischen A-Oligomere gelten daher als das ursächlich krankmachende Agens und sind damit vermutlich die entscheidende Ursache für die Entstehung und die Progression der AD.

  • Einmal entstandene A-Aggregate können sich durch einen Prion-ähnlichen Mechanismus vermehren [9,10].

Therapie
Aufgrund dieser Erkenntnisse müssen toxische A-Oligomere vollständig beseitigt sowie deren Prion-ähnliche Vermehrung verhindert werden, ohne dabei einen Einfluss auf die A-Monomer-Konzentration zu nehmen.

Genau dies wird aber von den bisher in der klinischen Erprobung befindlichen Medikamenten nicht angestrebt. Die Mehrzahl der derzeit in der klinischen Erprobung befindlichen Substanzen beruhen noch auf dem bisher diskutierten Entstehungsmechanismus der AD und zielen darauf, die Gesamtkonzentration von A oder von einzelnen A-Spezies, z. B. A(1-42), zu verringern. Dies soll u. a. durch aktive oder passive Immunisierung erreicht werden oder es wird z. B. versucht, die Bildungsrate von A-Monomeren zu verringern, indem - oder -Sekretasen inhibiert oder moduliert werden. Solange jedoch die physiologische Rolle der Monomere nicht bekannt ist, kann die Reduktion der Monomerkonzentration unvorhersehbare nachteilige Effekte haben, da den Monomeren ein positiver Einfluss auf Neuronen und auf kognitive Funktionen zugeschrieben wird [4]. Außerdem prozessieren - und -Sekretasen nicht nur das APP, sondern außerdem zahlreiche andere physiologisch wichtige Proteine, sodass durch eine Beeinflussung der - oder -Sekretase-Aktivität Nebenwirkungen zu befürchten sind. Leider kann hier nicht auf alle „konventionellen" Therapie-Strategien eingegangen werden.

Praktisch alle dieser entwickelten Wirkstoffe sind übrigens für eine lebenslange Anwendung geplant, obwohl mitunter mit deutlichen Nebenwirkungen zu rechnen ist und diese teilweise auch beobachtet wurden. Starke Nebenwirkungen sowie eine Verschlechterung der klinischen Symptome führten bereits zum Abbruch einiger klinischer Versuche [11]. Die meisten der bisher klinisch erprobten Substanzen konnten den Nachweis der Wirksamkeit nicht erbringen und schieden als potentielles Therapeutikum gegen AD aus. Erst kürzlich, im August 2012, wurde bekanntgegeben, dass die bis dahin aussichtsreichsten Wirkstoffe Solenazumab und Bapineuzumab jeweils in der klinischen Prüfung keine ausreichende Wirksamkeit zeigten und damit in der klinischen Erprobung als Mittel gegen AD gescheitert sind.

Neuer Ansatz
Aufgrund der neuen Erkenntnisse zum Wirkmechanismus der AD ist das Einschlagen eines neuen Weges zur kausalen Therapie der AD unabdingbar. Immer klarer wird, dass die Zerstörung der A-Oligomere das Ziel einer Behandlung sein muss. Ein kausal wirkender Wirkstoff zeichnet sich deshalb durch die folgenden Eigenschaften aus:

  • beseitigt gezielt und hocheffizient A-Oligomere
  • die durch die Behandlung entstehenden A-Spezies müssen unschädlich sein und dürfen die Prion-ähnliche Vermehrung der A-Oligomere nicht mehr unterstützen
  • soll möglichst wenig Einfluss auf die A-Monomerkonzentration haben

Genau diese Eigenschaften besitzt ein ­D-enantiomeres Peptid mit dem Namen „D3", das in unserer Arbeitsgruppe in einer Studie mittels Spiegelbild-Phagendisplay [12] entdeckt wurde. Dazu wurde in einer mehr als eine Milliarde großen Peptidbibliothek nach Substanzen gesucht, die möglichst affin und spezifisch an A-Monomere binden und diese damit im Gleichgewicht mit A-Aggregaten stabilisieren. Dadurch werden die A-Aggregate destabilisiert [13]. In vitro inhibiert D3 die Bildung von A-Fibrillen und reduziert die toxische Wirkung von A-Aggregaten in Zellkultur. Viel wichtiger ist jedoch, dass es toxische Oligomere gezielt zerstört und dass die dabei entstehenden Komplexe weder toxisch noch in der Lage sind, das Wachstum und die Vermehrung von amyloiden Aggregaten zu unterstützen. In vivo reduziert D3 die Plaque-Belastung und die Entzündungssituation im Gehirn transgener „Alzheimer"-Mäuse. Bedeutend ist, dass durch die Behandlung mit D3 die Gedächtnisleistung der transgenen Mäuse beim gezielten Training des Lernverhaltens verbessert wird [13,14]. Wir verfügen heute über deutlich effizientere D3-Derivate, von denen mindestens eines in die klinische Entwicklung gehen soll.

Im Vergleich zu anderen therapeutisch aktiven Substanzen, zielen D3 und seine Derivate spezifisch auf toxische A-Oligomere und nicht auf A-Monomere oder auf Enzyme, die an der Bildung von A-Monomeren beteiligt sind. Dadurch ist die Substanzgruppe wesentlich zielgenauer, womit auch Nebenwirkungen bei langandauernder Applikation reduziert werden können.

Diagnose
Biomarker, die die grundlegenden pathologischen Prozesse der AD wiederspiegeln sind von großem Interesse, um eine frühzeitige und präklinische Diagnose zu ermöglichen und um den Erfolg therapeutischer Ansätze zu kontrollieren. A-Aggregate können dabei der direkteste und zuverlässigste Biomarker für AD sein. Für deren Quantifizierung sind allerdings zwei technische Herausforderungen zu meistern. A-Monomere, die während des gesamten Lebens entstehen, müssen von A-Aggregaten zu unterscheiden sein. A-Oligomere, die nur in kleinsten Konzentrationen in Köperflüssigkeiten vorkommen, müssen dort in höchstmöglicher Empfindlichkeit detektiert werden.

Am Institut für Physikalische Biologie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf wurde ursprünglich für den Nachweis von Prionprotein-Aggregaten eine ultrasensitive Methode, „surface-based fluorescence intensity distribution analysis" (sFIDA), entwickelt. Damit werden mit höchster Sensitivität Prionprotein-Aggregate detektiert und quantifiziert [15]. Die Weiterentwicklung dieses Assays ermöglicht den Nachweis von A-Aggregaten in Körperflüssigkeiten. Mittels sFIDA ist eine Detektion einzelner Aggregate möglich, welche eine genaue Quantifizierung der Aggregatanzahl ermöglicht, sowie weiterhin Aussagen über Größe und Zusammensetzung der Aggregate zulässt. Untersuchungen mit synthetischen A-Aggregaten zeigten, dass das Verfahren in einem weiten Bereich von Aggregatkonzentrationen linear ist und Aggregat-Mengen bis in den unteren Picogramm-Bereich detektiert werden können, unabhängig von der Gegenwart von Monomeren. Erste vielversprechende Studien ergaben eine Unterscheidbarkeit von Rückenmarksflüssigkeiten gesunder Probanden und AD-Patienten mittels sFIDA. Außerdem konnte eine eindeutige Korrelation zwischen der Konzentration der A-Aggregate im Liqour und dem kognitiven Verfall beobachtet werden [16]. Die Konzentration von A-Aggregaten könnte also ein innovativer Biomarker sein, der nicht nur die bisherige AD-Diagnostik, ersetzen könnte, sondern erstmals die Möglichkeit einer Diagnose vor dem Auftreten klinischer Symptome eröffnet. Auch der Einsatz in der Begleitung klinischer Studien im sogenannten „Therapie-Monitoring" ist vorstellbar.

Danksagung
Die beschriebenen Projekte wurden bisher von der DFG (GRK1033), der Volkswagenstiftung, der EU, dem BMBF (Kompetenznetz Degenerative Demenzen; JPND Biomar-KAPD) und den Technologien-Transfer-Fonds des Forschungszentrums Jülich unterstützt. In den kommenden Jahren werden sie durch das BMBF (V.I.P.) und den Helmholtz-Validierungsfonds unterstützt.

Literatur
[1] Wimo A. und Prince M.: World Alzheimer Report 2010: The Global Economic Impact of Dementia. Alzheimer‘s Disease International, London 1-56 (2010)
[2] Masters C.L. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4245-9 (1985)
[3] Haass C. und Selkoe D.J.: Cell 75, 1039-1042 (1993)
[4] Puzzo D. und Arancio O.: J. Alzheimer‘s Dis. 33, 111-120 (2012)
[5] Hook V. et al.: Biol. Chem. 389, 993-1006 (2008)
[6] Hardy J. und Allsop D.: Trends Pharm. Sci. 12, 383-388 (1991)
[7] Finder V.H. und Glockshuber R.: Neurodegener. Dis. 4, 13-27 (2007)
[8] Benilova I. et al.: Nat. Neurosci. 15, 349-357 (2012)
[9] Jucker M. und Walker L.C.: Ann. Neurol. 70, 532-540 (2011)
[10] Stöhr J. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 11025-11030 (2012)
[11] Haas, C.: J. Alzheimer‘s Dis. 28 241-281 (2012)
[12] Wiesehan K. and Willbold D. ChemBioChem 4 811-815 (2003)
[13] vanGroen T. et al.: ChemMedChem 3 1848-1852 (2008)
[14] Funke S.A. et al.: ACS Chem. Neurosci. 1 639-648 (2010).
[15] Birkmann E. et al.: Biol Chem. 2006 387 95-102 (2006)
[16] Wang-Dietrich L. et al.: J. Alzheimers Dis. 34 985-994 (2013)

Weitere Beiträge zum Thema Alzheimer: http://bit.ly/GIT-Alzheimer
Mehr Informationen zur molekularen diagnostik: http://bit.ly/Molekulare-Diagnostik

 

 

Autor(en)

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Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Institut für Pharmazeutische Biologie
Universitätsstr. 1
40225 Düsseldorf
Telefon: +49 211 81 00
Telefax: +49 211 342229

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