Auf der Suche nach zirkulierenden Tumorzellen im Blut

  • Abb. 1: Modul zur Probeninkubation, unten: Einfachmischkammer für die direkte Isolierung der CTC aus Blut (Positivselektion)Abb. 1: Modul zur Probeninkubation, unten: Einfachmischkammer für die direkte Isolierung der CTC aus Blut (Positivselektion)
  • Abb. 1: Modul zur Probeninkubation, unten: Einfachmischkammer für die direkte Isolierung der CTC aus Blut (Positivselektion)
  • Abb. 1: Modul zur Probeninkubation, oben: Einfachmischkammer für die direkte Isolierung der CTC aus Blut (Positivselektion) unten: Doppelmischkammer, in der zwecks Vermeidung falsch positiver Ergebnisse vor Isolierung der CTC die Leukozyten entfernt werden (Negativselektion).
  • Abb. 2: Polymerchip für die simultane Amplifikation mehrerer unterschiedlicher Nukleinsäurefragmente (RT-MLPA, Reverse Transcription – Multiplex Ligation- dependent Probe Amplification). Die benötigten Reagenzien sind im Chip enthalten.
  • Abb. 3: Detektions-Elektrodenarray. Links: Sensorarray mit 4x4 Elektroden
  • Abb.3 rechts: Sensorarray mit 64 Elektroden
  • Abb. 4: Prototyp eines Gesamtsystems zur Isolation zirkulierender Tumorzellen aus Blut.

Jede gesunde Zelle im menschlichen Körper hat eine bestimmte Funktion und versieht diese Aufgabe bis zum Ablauf ihres Lebenszyklus. Versagen die Kontrollmechanismen und kommt es hierdurch zu unkontrollierten Wachstums- und Teilungsprozessen, so ist die Basis entstanden für bösartige Gewebeneubildungen. Diese zerstören benachbartes gesundes Gewebe und breiten sich über Blut oder Lymphsystem im Körper des Menschen weiter aus. Die Folge: der Betroffene erkrankt an Krebs.

Obwohl in Deutschland im Jahresdurchschnitt mehr als anderthalb mal so viele Menschen an Herz-Kreislauf-Erkrankungen sterben wie an Krebs, schockiert die Diagnose „Krebs“ immer noch wie kaum eine andere. Legt man den aktuell veröffentlichten Datenbestand der GEKID (Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V.) von 1980 bis 2006 zugrunde, so ist die altersstandardisierte Krebssterblichkeit zwar rückläufig, gleichwohl stieg aber im gleichen Zeitraum die Zahl der Neuerkrankungen nahezu durchgängig an.

Neue Therapien

Fortschrittliche neue Therapien und frühzeitige Erkennung sind die beiden wesentlichen Faktoren, über die sich grundsätzlich eine Verbesserung der Prognose des Patienten erreichen lässt. In diesem Zusammenhang haben die Isolierung zirkulierender Tumorzellen (CTC) im Blut sowie die Isolierung disseminierter Tumorzellen (DTC) im Knochenmark, deren zahlenmäßige Bestimmung und deren Charakterisierung in letzter Zeit stark an Bedeutung gewonnen. Im Gegensatz zu den im Knochenmark ruhenden Tumorzellen geben die CTC einen dynamischen Einblick in Entstehung und Verlauf der Krankheit sowie die Wirksamkeit gewählter therapeutischer Ansätze.

Prognosen bezüglich Krankheitsverlauf und Rezidiv- Wahrscheinlichkeit könnten so entscheidend verbessert werden. Das Aufspüren dieser extrem seltenen Zellen gleicht aber der berüchtigten Suche nach „der Stecknadel im Heuhaufen“. In diagnostisch ungünstigen Fällen ist damit zu rechnen, dass 1ml Vollblut nur eine dieser zirkulierenden Tumorzellen enthält. Übersetzt in ein vorstellbares Maß bedeutet dies, dass von 1000 Heuhaufen im Durchschnitt nur einer eine Stecknadel enthält, oder, anders ausgedrückt, dass sich in Mitten von Millionen weißer und roter Blutkörperchen eine CTC befindet. Wie in vielen anderen Fällen (z.

B. Infektionsdiagnostik, Umweltanalytik, Gefahrenabwehr) bilden die Mikrofluidik und ihre Anwendung in sogenannten chip-basierten Laboren (Lab-on-a-Chip) auch in der Krebsdiagnostik die Basis für vielversprechende Entwicklungsansätze (siehe Kasten). Der kosteneffiziente Einsatz von Polymermaterialien in der Fertigung erlaubt es, Einwegprodukte zu realisieren und so Kontaminationsrisiken zu verringern. Auf dem Weg von der Blutprobe des Patienten bis hin zum gewünschten Analyseergebnis durch ein Lab-on-a-Chip System gilt es im Falle der zirkulierenden Tumorzellen zunächst folgende Schritte in den Griff zu bekommen:

  • Probeninkubation
  • Immunomagnetische Zellanreicherung
  • Lyse der Zellen
  • Isolation der Boten-RNA
  • Vervielfältigung und Erzeugung des komplementären DNA-Abschnitts
  • Hybridisierung
  • Detektion

Bei der Inkubation (Abb. 1) wird die Voraussetzung für eine möglichst einfache und effiziente Isolierung der entsprechenden Boten-RNA (mRNA) der Zielzelle geschaffen. Dazu werden mehrere Milliliter des Probenmaterials mit Kügelchen eines definierten Durchmessers (Beads) vermischt, die nicht nur magnetische Eigenschaften besitzen, sondern deren Oberfläche auch so mit Kopplungsgruppen (Antikörpern) beschichtet ist, dass eine Bindung an die Zielzelle erfolgt. Dabei ist es wichtig, dass Antikörper auch für die Tumorzellen zur Verfügung stehen, die im menschlichen Körper Umwandlungsprozesse durchlaufen und so einen Teil ihrer ursprünglichen Charakteristika verloren haben.

Der nächste Prozessschritt dient dazu, sowohl ungebundene Beads als auch Reste störender Zellen (z. B. Leukozyten) vor der weiteren Verarbeitung der Probe zu entfernen. Die denkbaren Techniken reichen von einfachem passiven Filtern bis hin zu aktiven Filtermethoden, bei denen mittels in der Porenstruktur implementierter Elektroden sowohl eine quantitative Bestimmung der verbliebenen CTCs bis hin zu einer Differenzierung und gezielten Lyse verschiedener Zelltypen erfolgen kann. Ist die mRNA isoliert, wird zunächst durch einen Umschreibeprozess (reverse Transkription) aus der mRNA der komplementäre DNA-Abschnitt erzeugt (cDNA) und die cDNA-Menge durch eine Voramplifikation erhöht.

Anschließend erfolgen Hybridisierung und Ligation der spezifischen Primer, Amplifikation der spezifischen Sequenzen sowie Verdünnen der Probe für die Detektion. Der Umfang der im Rahmen des RT-MLPA-Prozesses (Abb. 2) stattfindenden Amplifikation erlaubt durch die Verwendung von Vergleichssequenzen (housekeeping genes) dann wiederum einen unmittelbaren Rückschluss auf die CTC-Zahl in der Probe. Für eine erfolgreiche Umsetzung im mikrofluidischen Chip wird ein geeignetes biokompatibles Polymermaterial benötigt. Präzise Temperatursteuerung, Fluidkontrolle und effiziente Vermischung sind erforderlich.

Für die Detektion der aus der RTMLPA resultierenden DNA-Sequenzen kann ein Array aus elektrochemischen Sensoren eingesetzt werden (Abb. 3), mit dem sich im Idealfall ein Genexpressionsprofil (Spiegel von Zustand und Funktion der Zelle) der Zielzellen erstellen lässt. Ist die Funktion der Einzelmodule für Isolation der CTC und Detektion beherrscht, werden im nächsten Schritt die Module optimiert und zu einem Gesamtsystem integriert (Abb. 4).

Dabei stehen vor allem einfache Handhabbarkeit, Robustheit und Herstellbarkeit mittels Massenfertigungstechnologien für eine spätere Kommerzialisierung im Vordergrund. Über den gezeigten Ansatz hinausgehend wäre es von Vorteil, jede Zelle individuell zu charakterisieren, um so einen besseren Einblick in die zur Entartung führenden Vorgänge zu erhalten. Hierfür müssen die Anzahl der isolierten CTC bestimmt und diese getrennt werden.

Voraussetzung für die Einzelzellanalyse ist jedoch auch die Identifizierung der spezifischen Marker, die zur Bestimmung des genauen Entartungsgrads einer Zelle gebraucht werden. Daran wird aktuell intensiv gearbeitet. Erst wenn spezifische Marker mit robusten, mikrochip-basierten Systemen kombiniert werden, erhält man einfache Point-of-care- oder Point-of-use- Geräte, wie sie in Arztpraxen, Krankenhäusern, aber vielleicht irgendwann auch vom Patienten selbst angewendet werden können. Hinweis: Die Arbeiten wurden teilweise gefördert durch das 6. Rahmenprogramm der EU [FP6-2004- IST-4]; 027652.

Ausgewählte themenbezogene Entwicklungsvorhaben mit Beteiligung des Instituts für M ikrotechnik in Mainz, 6. und 7. Rahmenprogramm EU, (Projektname, Förderkennzeichen):

  • Verbesserte Krebsdiagnostik und -therapie durch integriertes Lab-on-a-Chip System (MIRACLE; 257743)
  • Nachweis zirkulierender Tumorzellen in der Krebsdiagnostik und Therapieüberwachung (MASCOT; 027652)
  • Modulare Plattform für integrierte Biosensoren zur Krebsdiagnostik (SmartHEALTH; 016817)
  • Automatisierte Detektion krankheitsspezifischer molekularer Zellaktivitäten (MICROACTIVE; 017319)

 

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