Autoantikörperdiagnostik standardisiert

Immunologischer Autoantikörpernachweis im Routinealltag

  • Abb. 1: Kombinierte Screening- und Bestätigungsanalyse von ANCA in einer Reaktionsumgebung mittels IIF auf äthanolfixierten humanen Granulozyten (äthN) und antigenbeschichteten Mikropartikeln. Eine Proteinase 3 (PR3)-positive Serumprobe im Rahmen der ANCA Diagnostik zeigt mittels der Cytobead Technologie eine positive quantifizierbare Fluoreszenz auf äthN und PR3-beschichteten Mirkopartikeln. Mikropartikel mit Myeloperoxidase (MPO) und dem Antigen der glomerulären Basalmembran (GBM) wurden nicht gefärbt.Abb. 1: Kombinierte Screening- und Bestätigungsanalyse von ANCA in einer Reaktionsumgebung mittels IIF auf äthanolfixierten humanen Granulozyten (äthN) und antigenbeschichteten Mikropartikeln. Eine Proteinase 3 (PR3)-positive Serumprobe im Rahmen der ANCA Diagnostik zeigt mittels der Cytobead Technologie eine positive quantifizierbare Fluoreszenz auf äthN und PR3-beschichteten Mirkopartikeln. Mikropartikel mit Myeloperoxidase (MPO) und dem Antigen der glomerulären Basalmembran (GBM) wurden nicht gefärbt.
  • Abb. 1: Kombinierte Screening- und Bestätigungsanalyse von ANCA in einer Reaktionsumgebung mittels IIF auf äthanolfixierten humanen Granulozyten (äthN) und antigenbeschichteten Mikropartikeln. Eine Proteinase 3 (PR3)-positive Serumprobe im Rahmen der ANCA Diagnostik zeigt mittels der Cytobead Technologie eine positive quantifizierbare Fluoreszenz auf äthN und PR3-beschichteten Mirkopartikeln. Mikropartikel mit Myeloperoxidase (MPO) und dem Antigen der glomerulären Basalmembran (GBM) wurden nicht gefärbt.
  • Abb. 2: Intensitätsverteilung einer positiven Immunfluoreszenz einer anti-SSA Autoantikörper positiven Probe auf einer HEp-2-Zelle zur Bestimmung von antinukleären Autoantikörpern. Bei der digitalen Bilderfassung muss gewährleistet werden, dass keine Information durch Über- oder Unterbelichtung verloren geht. Blaue Fluoreszenz: Anfärbung der DNS durch DAPI, Grüne Fluoreszenz: spezifische Anfärbung der gebundenen anti-SS-A Autoantikörper. A: unterbelichtet, B: korrekt bellichtet, C: überbelichtet
  • Abb. 3: Verwendung von neuartigen Kalibrierobjektträgern auf der Basis von fluoreszenzmarkierten Mikropartikeln zur Standardisierung von Messungen mittels indirekter Immunfluoreszenz. Über die Ermittlung der mittleren Fluoreszenzintensität der homogen auf den Objektträger aufgetragenen Mikropartikel (A) lässt sich die Intensität des Anregungslichts der lichtemittierenden Diode (LED) als Lichtquelle standardisieren (B).

Krankheitstypischen Autoantikörpern, die Bestimmung dieser ist ein wesentlicher Bestandteil der Diagnostik von systemischen rheumatischen und organspezifischen Autoimmunerkrankungen. Durch die große Vielfalt an Nachweismethoden, den innovativen Charakter vieler Parameter und die Heterogenität der Analyte sind die Befunde zwischen den Laboratorien bislang nur eingeschränkt vergleichbar. Neueste technische Entwicklungen machen es möglich, die Verfahren stärker zu harmonisieren und damit zwischen den Laboren vergleichbarer zu gestalten.

Autoimmunerkrankungen stellen in ihrer Gesamtheit in den industrialisierten Ländern die dritthäufigste Krankheitsgruppe nach Herz-Kreislauf- und Tumorerkrankungen dar. Bei den meisten Autoimmunerkrankungen ist die diagnostische Relevanz der entsprechenden Autoantikörper gut bekannt, jedoch gibt es noch zahlreiche diagnostische Lücken zu schließen. Trotz der langjährigen Erfahrungen mit Autoantikörpernachweisen gelingt es erst in letzter Zeit, Harmonisierung und Standardisierung und damit verbunden auch eine sinnvolle Automatisierung einzuführen.

Beim Verdacht auf eine autoimmun bedingte Erkrankung steht natürlich, wie stets in der Medizin, die klinische Untersuchung im Vordergrund. Daran schließen sich einfache Untersuchungen auch im Labor an, bevor die gezielte Betreuung meistens durch einen Spezialisten fortgeführt werden muss. Da sich die meisten Patienten zuerst an ihren Hausarzt wenden, haben die österreichischen und deutschen Mitglieder der EASI-Initiative (www.easi-network.com) gemeinsam mit Kollegen 2013 das Buch ”Autoimmunerkrankungen – ein Leitfaden für Hausärzte” veröffentlicht, um das Bewusstsein für Autoimmunerkrankungen zu verbessern und gleichzeitig die diagnostischen Wege für solche Patienten aufzuzeigen. Bei EASI arbeiten Ärzte und Wissenschaftler zusammen, die in wissenschaftlichen medizinischen Fachgesellschaften gezielt an der medizinischen Labordiagnostik interessiert sind: in der Gesellschaft zur Förderung der Immundiagnostik (www.gfidev.de), in der Sektion Immundiagnostik der Deutschen Vereinten Gesellschaft für Klinische Chemie und Labordiagnostik (www.dgkl.de), in der Gesellschaft für Immunologie (www.dgfi.org) und in mehreren klinischen Fachgesellschaften.

Bei dem Verdacht auf Vorliegen oder Entwicklung einer Autoimmunerkrankung sollte parallel zur Bestimmung von Basisparametern (Entzündungsmarker, Marker für Organmanifestationen) auch die Bestimmung von für die Verdachtsdiagnose relevanten Autoantikörpern erfolgen, da diese für das weitere Vorgehen (Differentialdiagnostik) wegweisend sind.

Eine sinnvolle serologische Diagnostik von Autoantikörpern erfordert die gezielte Auswahl derselben. Als sehr hilfreich diesbezüglich erweisen sich dabei zwei diagnostische Leitfäden von Karsten Conrad, Werner Schößler und Falk Hiepe, „Autoantikörper bei systemischen Autoimmunerkrankungen” und ”Autoantikörper bei organspezifischen Autoimmunerkrankungen”, welche regelmäßig aktualisiert erscheinen.

Nachweis von Autoimmunerkrankungen im Labor
Hier beginnt der Nachweis vor allem für systemische entzündliche rheumatische Erkrankungen typischerweise mit Screeningtests, deren Auswahl aber von der mitgeteilten Verdachtsdiagnose abhängig ist. Damit kann die klinische Verdachtsdiagnose bestätigt werden; zudem sind erste Aussagen über Verlauf, Prognose, Komplikationen und natürlich zu spezifischen Differentialdiagnosen möglich. Im Allgemeinen ist die Autoantikörperbildung am stärksten ausgeprägt, wenn eine akute klinische Krankheitsaktivität vorliegt. Bei Verdachtsdiagnosen wie z. B. systemischem Lupus erythematodes, Sjögren-Syndrom, Sklerodermie, Mischbindegewebserkrankung (mixed connective tissue disease), autoimmuner Hepatitis, juveniler chronischer Arthritis (JCA) ist der Nachweis von antinukleären Antikörpern (ANA) sehr wichtig. Andere sehr wichtige Autoantikörper sind bei Verdacht auf rheumatoide Arthritis (RA) Antikörper gegen zitrullinierte Peptide (CCP) und Rheumafaktoren (RF), bei wiederholten venösen oder arteriellen Thrombosen als auch Schwangerschaftskomplikationen anti-Phospholipid-Antikörper (APA), und bei systemischen Vaskulitiden anti-neutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA). Bei den ANCA handelt es sich zudem um die einzige Art von Autoantikörpern, deren Nachweis heute als immunologische Notfalluntersuchung bei rapid-progressiver Glomerulonephritis gelten darf.

Wenn der Screeningtest auf ANA mittels indirekter Immunfluoreszenz ein positives Ergebnis ergibt, kann damit der klinische Verdacht auf eine systemische rheumatische entzündliche Erkrankung untermauert werden und sollte genauer spezifiziert werden. Schwach positive Ergebnisse sind hingegen oft unspezifisch, vor allem im fortgeschrittenen Alter. Da sich häufig Zusammenhänge zwischen dem Krankheitsverlauf und der Höhe von Autoantikörpern finden, ist ein objektivierbares Messverfahren sehr wichtig.

Assaytechniken in der Autoimmundiagnostik
Grundsätzlich gibt es in der Autoimmundiagnostik derzeit zwei Hauptassaytechniken: die indirekte Immunfluoreszenz (IIF) an Zellen oder Gewebeschnitten sowie immunologische nichtkompetitive Festphasen- Assaytechniken, zu denen Enzym-, Radio-, Chemilumineszenz- und Fluoreszenzimmunoassays sowie Line/Dot-Immunoassays oder auch Beadarrays gehören und bei denen ausgewählte Einzelautoantigene zum Einsatz kommen. Neuerdings wird auch die Kombination der beiden Assaytechniken für die gleichzeitige effektive Screening- und Bestätigungsanalyse von Autoantikörpern empfohlen (Abb. 1). Der Nachweis von autoreaktiven T-Zellen ist noch rein experimentell und hat noch keine Praxisrelevanz. Obwohl sich immunologische Festphasen-Immunoassays einfacher automatisieren lassen, gelten sie für die Screeninguntersuchungen nur als eingeschränkt nutzbar. Dies liegt insbesondere daran, dass bei der Immunfluoreszenz mit den fixierten Zellen ein „biologischer Multiparameterchip“ zur Verfügung steht, der wesentlich mehr potentielle Autoantigene aufweist als alle Tests mit gereinigten oder rekombinanten Einzelantigenen. Die EASI favorisiert daher in Übereinstimmung mit den internationalen Empfehlungen, beim initialen Screening auf die IIF zurückzugreifen oder ansonsten genau anzugeben, auf welche Einzelantigene sich das Screening beschränkt hat (1).

Standardisierung in der Diagnsotik
Da der Einsatz der IIF unverzichtbar scheint, wird versucht, diese Untersuchung stärker zu standarisieren (2). Dies ist eingebettet in die Qualitätssicherungsmaßnahmen, denen sich jedes medizinisch- diagnostische Labor unterziehen muss, seien es die grundsätzlich zutreffenden Richtlinien der Bundesärztekammer oder die Akkreditierung nach ISO/ EN 15189 (3). Geeignete Räumlichkeiten, Ausstattung, qualifiziertes Personal mit regelmäßiger spezifischer Weiterbildung, Maßnahmen der internen und externen Qualitätssicherung und sinnvolle medizinische Befundung sind nur einige der zentralen Punkte bei einer optimalen Autoimmundiagnostik.

Daneben ist es in den letzten Jahren gelungen, die Autoantikörperdiagnostik mittels indirekter Immunfluoreszenz weiterzuentwickeln, zu objektivieren und zum Teil zu automatisieren. Grundvoraussetzungen waren Methoden zur automatischen Analyse von Immunfluoreszenzbildern (4;5), die mittlerweile die Entwicklung mehrerer kommerziell erhältlicher Interpretationssysteme ermöglicht haben. Wichtig ist dabei eine optimale objektive Erfassung von Fluoreszenzbildern und -signalen, die ohne Informationsverlust einhergehen muss und nicht immer dem entspricht, was von einem Bediener visuell als „brilliant“ bewertet wird (Abb. 2). Mittlerweile ist es möglich, mit diesen Systemen ANA, aber auch ANCA oder Autoantikörper gegen native DNS automatisch zu bestimmen und zu klassifizieren. Zudem wird über die Nutzung der digitalen Fluoreszenz als quantifizierbare Methode und neuer Mikropartikel- basierter Kalibrationswerkzeuge die Standardisierung dieser Bestimmungen möglich (Abb. 3). Dadurch wird die IIF als analytische Technik auf eine Stufe mit bekannten quantifizierbaren Assaytechniken wie zum Beispiel Festphasenimmunoassays gestellt.

Aktuelle computergestützte und zum Teil automatisierte Interpretationssysteme stehen sicher noch am Beginn ihrer Einführung in die Routinediagnostik. Die Nutzung webbasierter lernfähiger Softwarelösungen wirft zwar für die IT-Verantwortlichen der diagnostischen Labors manche Hürde auf, führt aber auf der anderen Seite zur raschen Fortentwicklung der Erkennungsgenauigkeit, die schon heute kaum noch unter der von erfahrenen Autoimmundiagnostikern liegt (6 – 8).

Auf der anderen Seite gelingt diese Standardisierung nur, wenn entsprechende einheitliche Präparationsschritte im Labor im Rahmen der Präanalytik eingehalten werden. Serumverdünnungen, verwendete Konjugate, die Qualität der verwendeten biologischen Substrate in der IIF, Inkubationszeiten und -bedingungen haben einen unmittelbaren Einfluss auf die Ergebnisse.

Ausblick
Zusammenfassend ist festzuhalten, dass sich die Autoimmundiagnostik aus einer reinen Forschungsmethode zu einer bewährten und in der klinischen Praxis fest etablierten medizinischen Laborroutinemethode fortentwickelt hat. Das verfügbare Wissen und jüngste technische Entwicklungen vor allem auf dem Gebiet der digitalen Immunfluoreszenz gestatten eine zunehmende Harmonisierung und Standardisierung der Autoantikörperdiagnostik. Die Kombination von Assaytechniken in eine Reaktionsumgebung für die multiparametrische Bestimmung von Autoantikörpern wird zu einem Effektivitätszuwachs führen, der für eine indikationsbezogene Profilbestimmung von Autoantikörpern genutzt werden kann. Mittels solcher Assays ist zu erwarten, dass auch Patienten mit Erkrankungen, bei denen immunologische Phänomene bislang nicht im Zentrum der Aufmerksamkeit stehen, in naher Zukunft von der Autoantikörperdiagnostik profitieren können.

Literatur
[1] Agmon-Levin N, et al.: Ann Rheum Dis Jan 1;73(1):17-23 (2014)
[2] Sack U. et al.: Laboratoriumsmedizin-Journal of Laboratory Medicine May;36(3):135-41 (2012)
[3] ISO 15189-2003 Medical laboratories - Requirements for quality and competence. Geneva: ISO; (2012)
[4] Sack U. et al.: Autoimmunity Reviews 2003;2(5):298-304.
[5] Hiemann R. et al.: Automatic analysis of immunofluorescence patterns of HEp-2 cells. Ann N Y Acad Sci Aug; 1109: 358-71 (2007)
[6] Conrad K und Sack U.: Laboratoriumsmedizin- Journal of Laboratory Medicine35(6): 375-82 (2011)
[7] Knutter I. et al.: Arthritis Res Ther 2012 Dec 14;14(6):R271.
[8] Krieger T. in: Conrad K. et al.: From prediction to prevention of autoimmune disease. 7. ed. Lengerich: Pabst Science Publishers; p. 664-5 (2012)

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