Bildgebende MS in biomedizinischer Forschung und Diagnostik

Vielfältige Applikationsmöglichkeiten für die molekulare Analyse von Geweben

  • Abb.1: Prinzip der MALDI Imaging Massenspektrometrie.Abb.1: Prinzip der MALDI Imaging Massenspektrometrie.
  • Abb.1: Prinzip der MALDI Imaging Massenspektrometrie.
  • Abb. 2: Visualisierung verschiedener Proteine in Brustkrebsgewebe nach MALDI Imaging. Ein Protein (m/z 6225 (gelb)) wurde spezifisch in Tumorzellen nachgewiesen, wohingegen m/z 4969 (blau) ein Protein ist, das spezifisch im Tumorstroma vorkommt. Ein weiteres Protein, CRIP1 (m/z 8404 (rot)) hingegen zeigt eine stark erhöhte Expression in Tumorzellen von HER2-postivem (A) Brustkrebsgewebe und ist in Her2-negativem Brustkrebsgewebe (B) nicht nachweisbar. (Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz [9]. Copyright (2010) American Chemical Society.)
  • Abb. 3: Visualisierung der Verteilung eines Tyrosinkinase-Inhibitors in einem Gewebe durch MALDI Drug Imaging.
  • Abb. 4: MALDI Metabolomic Imaging: (A) Die in situ Darstellung von Molekülen des Zitratzyklus zeigt eine individuelle spezifische Verteilung in Abhängigkeit von verschiedenen Zeitpunkten in einem Modell für zerebrale Durchblutungsstörungen. (B) Anatomische Strukturen der coronaren Schnittebene durch das Gerhirn. (C) Relative quantitative Darstellung der Konzentrationen der gemessenen Metaboliten. (Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz Miura D. et al.: Anal Chem 82(23):9789-96 (2010). Copyright (2010) American Chemical Society.)

Die bildgebende Massenspektrometrie ermöglicht die Analyse der molekularen Zusammensetzung von Gewebeproben in Zusammenschau mit dem morphologischen Kontext. Diese Methode ist markierungsfrei und erlaubt die simultane Untersuchung von hunderten Analyten innerhalb einer Messung. Das große Potential der bildgebenden Massenspektrometrie führt zu einem breiter werdenden Spektrum von Applikationen für die Analyse von Geweben.

Massenspektrometrische Verfahren sind im Life Science Bereich ein weit verbreitetes analytisches Prinzip. Die bildgebenden Massenspektrometrie (Matrix-assisted laser desorption/ ionization Imaging – MALDI Imaging) erweitert die Anwendbarkeit dieser Methoden auf die molekulare Analyse von Geweben [1]. Mit dieser Methode wird die Korrelation der klassischen Histologie mit molekularer Bildgebung auf mikroskopischer Ebene ermöglicht und führt somit zu einer neuen Datenqualität in der biomedizinischen Forschung und molekularen Diagnostik. Die Methode ermöglicht es ein breiteres Spektrum von Analyten, Proteine und Peptide, Lipide, Komponenten des Stoffwechsels, aber auch Wirkstoffe und deren Metaboliten in Gewebeschnitten über ihre Massensignale zu lokalisieren. Ausgangsmaterialen sind konventionelle Gewebeschnitte, die im Massenspektrometer rasterartig (ortsaufgelöst) vermessen werden und dabei für jeden Messpunkt ein Massenspektrum erzeugt wird. Eine spezielle Software ermöglicht es anschließend die detektierten Massensignale in Farbsignale aufgrund ihrer Intensität zu visualisieren (Abb. 1). Mithilfe dieser Farbsignale lassen sich Muster erkennen, welche die Verteilung etwa von Proteinen und Peptiden im Gewebe darstellen.

Nach derzeitigem Stand der Technik ist eine laterale Auflösung von bis zu 20 Mikrometern möglich, die ausreichend ist, um kleine Zellverbände bis hin zu Einzelzellen zu vermessen.

Vom Gewebeschnitt zum ortsaufgelösten massenspektrometrischen Profil
Die derzeitige Anwendung der MALDI Imaging- Technik erfolgt überwiegend auf Gefriergewebe, sowie auch zunehmend in Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten (FFPE) Geweben [1]. Zur Analyse solcher FFPE Gewebe ist eine Vorbehandlung nötig. Ähnlich wie z.

B. bei anderen insitu Methoden sind die quervernetzten Proteine erst nach Hitzeeinwirkung und / oder enzymatischem Verdau analysierbar [2,3].

Vor der Analyse mittels MALDI Imaging muss das Gewebe so präpariert werden, dass die Analytmoleküle wie in der herkömmlichen MALDI Massenspektrometrie durch den Laser desorbiert und ionisiert werden können. Hierzu wird ein Gewebeschnitt auf einen Glasobjektträger aufgezogen, der mit Indium-Zinnoxid beschichtet ist, um elektrisch leitfähig zu sein. Nach einem Fixierschritt in Ethanol wird eine Matrixsubstanz (z. B. Zimtsäurederivate) aufgebracht. Die Matrix kann durch gezieltes Aufsprühen der gelösten Substanz in gleichmäßigen Schichten aufgebracht werden, wodurch das Gewebe gleichförmig mit kleinen Matrixkristallen überdeckt wird. Nach der Probenpräparation wird der Schnitt mittels Massenspektrometrie rasterartig vermessen (Abb. 1).

Mittels einer Steuersoftware wird auf dem Gewebe ein virtuelles Raster von Messpunkten abgemessen. Über jedem Messpunkt wird ein Massenspektrum erzeugt (Abb. 1). Je nach Schnittgröße entstehen so automatisch mehrere tausend Spektren, die jeweils ortskorreliert abgespeichert werden. Der Schnitt wird anschließend mit Lösungsmitteln von der Matrix befreit und routinemäßig mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt. Zur Analyse werden die Spektren in einem ersten Schritt farbkodiert wiedergegeben und eine „Massenlandkarte“ erzeugt. Die virtuelle Massenlandkarte wird mit dem digitalen Bild des verwendeten Schnittes nach HEFärbung überlagert. Somit ist eine unmittelbare Korrelation der massenspektrometrischen Daten mit der Histologie gegeben (Abb. 1).

Im zweiten Schritt der Auswertung werden am HE-gefärbten Präparat z. B. gesunde Gewebsanteile bzw. Tumorareale als „regions of interest“ (ROIs) definiert. Innerhalb dieser Areale generierte Spektren werden zur weiteren bioimformatischen Aufarbeitung exportiert. So kann auf der Basis von Mustern eine Klassifizierung der Spektren erfolgen (z. B. gesund gegen Tumor). Ein mögliches Vorgehen ist z.B. die Datenanalyse mittels hierarchischem Clustering.

Applikationen der bildgebenden Massenspektrometrie
Die bildgebende Massenspektrometrie ermöglicht die Suche nach neuen krankheitsspezifischen Biomarkern, metabolomische Komponenten des Stoffwechsels, oder die Detektion von Pharmaka und deren Metaboliten in Geweben [4,5,6]. Identifikation von Biomarker Durch die mittels MALDI Imaging erhaltenen unterschiedlichen Protein- und Peptidsignaturen lassen sich Biomarker in Geweben identifizieren, die z. B. den Krankheitsverlauf, das Therapieansprechen oder das Überleben von Patienten beschreiben können. So konnte mittels MALDI Imaging an einem Patientenkollektiv gezeigt werden, dass proteomische Marker in Tumorgeweben mit dem Ansprechen auf eine neoadjuvante Therapie mit Paclitaxel bei Brustkrebs assoziiert sind [7]. In einer anderen Studie wurden spezifische Biomarker im erkrankten Lymphknotengewebe identifiziert, mit deren Hilfe ein Hodgkin-Lymphome von einer Lymphadenitis unterschieden werden konnten [8]. Auch die Erfassung von Proteinsignaturen bzw. -mustern, die bereits bekannte molekulare, zum Beispiel prädiktive Marker widerspiegeln, ist möglich. So konnte in zwei Studien ein Proteinprofil beschrieben werden, das den HER2-Rezeptorstatus bei Mamma- und Magenkarzinomen mittels MALDI Imaging vorhersagt (Abb. 2) [9,10]. In einer kürzlich veröffentlichen Studie ermöglichte der Einsatz von MALDI Imaging die Detektion von bisher unerkannten Defekten in der Atmungskette von Mitochondrien die zu einem individuellen Ansprechen von Patienten auf eine Cisplatin-basierte Chemotherapie beim fortgeschrittenen Adenokarzinom des Ösophagus führen [11]. Auch die Detektion von Modifikationen von Proteinen ist möglich, wie kürzlich für Histonmodifikationen im Kontext von Hepatozellulären Karzinomen gezeigt wurde [12].

Pharmakologische Wirkstoffe und deren Metaboliten
Die Entwicklung und Erforschung neuer Wirkstoffe wird durch die bildgebende Massenspektrometrie um eine neuartige Analysetechnik bereichert. Das sogenannte MALDI Drug Imaging ermöglicht die Detektion der Verteilung und Quantifizierung von Pharmaka und deren Metaboliten im Gewebe [1]. Auf diese Weise können pharmakologische Wirkungen von Arzneistoffen im histologischen Zusammenhang erklärt und wertvolle Informationen über deren Wirkung gewonnen werden (Histopharmakologie). MALDI Drug Imaging kann in den frühen Phasen der Entwicklung von Wirkstoffen einen Beitrag leisten.

FmöHerkömmliche Methoden zur Darstellung von Wirkstoffen sind die Autoradiographie, sowie LC-MS („Liquid chromatography – mass spectrometry“) Analysen aus Gewebehomogenat. Im Gegensatz zu diesen Methoden ist mit MALDI Drug Imaging zur Darstellung von Wirkstoffen im Gewebe keine (radioaktive) Markierung der Analyten erforderlich wie z.B. bei der Autoradiographie. Im Vergleich zur Autoradiographie, bei der typischerweise nur ein Analyt pro Versuchsdurchführung nachgewiesen werden kann, können mittels MALDI Drug Imaging nahezu beliebig viele Komponenten simultan bestimmt werden. Im Vergleich zu LC-MS Analysen liegt die Stärke des MALDI Drug Imagings in der örtlichen Darstellung von Wirkstoffen und deren Metaboliten. Durch die Möglichkeit der simultanen Messung von Wirkstoffen, Metaboliten, Peptiden etc. werden durch MALDI Drug Imaging auch gleichzeitig Untersuchungen möglich die darüber aufklären können, wie ein Gewebe auf die Gabe eines Wirkstoffs reagiert. Des Weiteren kann durch MALDI Drug Imaging auch erkannt werden, wie ein Wirkstoff sich im Organismus verteilt, wie bestimmte Wirkstoff-Interaktionen ablaufen, wie und wo der Transport und die Metabolisierung von statten gehen. Das MALDI Drug Imaging bietet so einen innovativen Lösungsansatz für verschiedenartige Fragestellungen der Pharmakologie und Toxikologie. In Abbildung 3 ist an einem Beispiel gezeigt, wie sich ein Tyrosinkinase-Inhibitor in einem Gewebe verteilt.

Moleküle des Stoffwechsels
Das Metabolom umfasst alle kleinen Moleküle einer Zelle, eines Gewebes oder Organismus, die für metabolische Reaktionen wie zum Beispiel für Wachstum oder Erhaltung benötigt werden.

Die Analyse von endogenen Metabolitprofilen in Geweben nach verschiedenen Behandlungen oder unter verschiedenen anderen Einflüssen kann zu einem vertieften Verständnis von krankeitsrelevanten Mechanismen, diagnostischen Biomarkern, Wirkmechanismen von Pharmaka, sowie individuellen Reaktionen eines Organismus auf Wirkstoffe führen. Ähnlich wie bei Wirkstoffanalysen ist auch bei der Analyse des Metaboloms der Einsatz von massenspektrometrischen Techniken wie LC-MS oder GC-MS (gas chromatography – mass spectrometry) die am häufigsten zum Einsatz kommende Strategie zur Erforschung des Metaboloms. Auch hier führt die Anwendung dieser Techniken zum Verlust der Information der Lokalisation der Analyten im Gewebe. Der Einsatz der MALDI Metabolome Imaging Technik führte hier zu einer neuen Ergebnisqualität durch Einbeziehung der ortsaufgelösten Darstellung der Analyten.

Die ersten MALDI Metabolome Imaging Studien fokusierten sich zunächst auf die Detektion von lipidomischen Komponenten des Metaboloms wie z.B. Glycerophospholipide [13]. Durch die technologische Weiterentwicklung dieser Technik konnten bald weitere Komponenten des Stoffwechsels nachgewiesen werden. In einem Modell für zerebrale Durchblutungsstörungen konnten mehr als 30 Metaboliten (Nucleotide, Co-Faktoren, Phosphorylierte Zucker, Aminosäuren, Lipide, Carbonsäuren) identifiziert werden, sowie ihre individuelle spezifische Verteilung im Gehirn einer Ratte gezeigt werden (Abb. 4) [14]. Eine weitere Arbeit am gleichen Krankheitsmodell berichtete von temporalen örtlichen Veränderungen im Energiemetabolismus im Zusammenhang mit einer fokalen Ischämie [15].

Die gewonnen Erkenntnisse über die örtliche Verteilung von Metaboliten in Geweben erlauben so die direkte Zusammenschau mit sich histopathologisch manifestierenden Prozessen und führen so zu einem vertieften Verständnis der Pathophysiologie.

Fazit
Die zukunftsweisende Technologie der bildgebenden Massenspektrometrie befindet sich in einem steilen Entwicklungsstadium. MALDI Imaging Anlysen sind einfach durchführbar und benötigen nur wenig Probenmaterial. Die Korrelation von Histomorphologie mit einem molekularen bildgebenden Verfahren führt zu einer neuen Qualität von Daten für die medizinischen Forschung und Diagnostik, die es erlaubt, molekulare Zusammenhänge von Krankheiten und deren Behandlung besser zu verstehen. Derzeitige Hauptanwendungsbereiche dieser Technik umfassen die molekulare Histologie, die Suche nach neuen krankheitsspezifischen Biomarkern die Detektion von Pharmaka und deren Metaboliten, sowie die Untersuchung des Metaboloms im Gewebe.

Literatur
[1] Norris J.L. und Caprioli R.M.: Chem Rev. 113(4): 2309-42 (2013)
[2] Stauber J. et al.: J Am Soc Mass Spectrom. 21(3): 338-347 (2010)
[3] Seeley E.H. und Caprioli R.M.: Trends Biotechnol. 29(3): 136-143 (2011)
[4] Balluff B. et al.: Gastroenterology. Sep;143(3): 544- 9.e1-2 (2012)
[5] Miura D. et al.: J Proteomics. 75(16): 5052-60 (2012)
[6] Schwamborn K. und Caprioli R.M.: Nat Rev Cancer. 10(9):639-46 (2010)
[7] Bauer J.A. et al.: Clin Cancer Res. 16(2):681-90 (2010)
[8] Schwamborn K. et al.: J Cancer Res Clin Oncol. 136(11): 1651-5 (2010)
[9] Rauser S. et al.: J Proteome Res. 9(4):1854-63 (2010)
[10] Balluff B. et al.: J Proteome Res. 9(12):6317-22 (2010)

Weitere Literatur ist bei den Autoren erhältlich.

Kontakt
Dr. Michaela Aichler, Prof. Dr. Axel Walch
Helmholtz Zentrum München
Abteilung Analytische Pathologie
Neuherberg
michaela.aichler@helmholtz-muenchen.de

Autor(en)

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85764 Oberschleißheim
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