Diagnostik von Stoffwechselkrankheiten

Metabolitanalytik mit einem Twin Line GC-MS-System

  • Abb. 1: Chromatogramm der organischen Säuren im Urin eines gesunden Probanden. Die Hauptkomponenten sind 2-Oxoglutarsäure und Hippursäure zusammen mit 2-Phenylbuttersäure als interner Standard.
  • Abb. 2: Chromatogramm der organischen Säuren im Urin eines Patienten mit Tyrosinämie Typ 1 (Fumarylacetoacetasemangel), einer angeborenen Störung des Tyrosinstoffwechsels. Im Vergleich zum internen Standard (2-Phenylbuttersäure), ist eine deutlich verstärkte Urinausscheidung von 4-Hydroxyphenyllaktat und 4-Hydroxyphenylpyruvat sowie von Succinylaceton, charakteristisch für eine Tyrosinämie Typ 1 [9].
  • Abb. 3: Massenchromatogramme der VLCFAs im Plasma einer gesunden Kontrollperson.
  • Abb. 4: Chromatogramm eines Patienten mit M. Refsum (erhöhte Phytansäure).

Die Diagnostik von Stoffwechelkrankheiten:

Angeborene Störungen des intermediären Stoffwechsels führen zur Anhäufung erhöhter Mengen an Metaboliten, deren Nachweis als diagnostischer Hinweis dient. Die gaschromatographisch-massenspektrometrische Analyse von organischen Säuren und ultralangkettigen Fettsäuren mit einem Twin Line Gerät ist eine effektive und kostensparende Ergänzung für das Stoffwechsellabor.

Die Kenntnis über angeborene Stoffwechselkrankheiten ist eines der jüngsten Spezialgebiete der Medizin. Sir Archibald Garrod postulierte als erster einen kausalen Zusammenhang Mendelscher Vererbungsregeln mit phänotypischen Merkmalen und chemischen Veränderungen des Stoffwechsels [1]. Seiner Zeit weit voraus erkannte er, dass diesen Leiden eine autosomal rezessive Vererbung zu Grunde liegt und vermutete als mögliche Ursache eine Veränderung oder das Fehlen eines Enzyms. Ein solcher Enzymdefekt kann zur Folge haben, dass sich Stoffwechselprodukte ansammeln oder ein Mangel von diesen auftritt. Beides kann zu klinischen feststellbaren Symptomen führen. Mittlerweile sind viele angeborene Gendefekte beschrieben und über 300 Enzymdefekte charakterisiert [2,3].

Organische Säuren
Angeborene Störungen des Stoffwechsels organischer Säuren schließen eine heterogene Gruppe von Erkrankungen ein, deren Biochemie viele Bereiche des Intermediärstoffwechsels umfasst. Dies bezieht sich auf den Stoffwechsel der Aminosäuren, besonders der verzweigtkettigen und aromatischen Aminosäuren, auf die Abbauwege der Fettsäuren einschließlich der Ketogenese sowie auf den Kohlenhydratmetabolismus (Zitronensäurezyklus). Allen Erkrankungen gemeinsam ist die Akkumulation von organischen Säuren, deren Estern und Konjugaten in Körpergeweben und Körperflüssigkeiten, insbesondere im Urin. Neben diesen organischen Säuren können bei einigen Organoazidurien Glycinkonjungate der Mono- bzw. Dicarbonsäuren entstehen.
Zusätzlich zu diesen biochemischen Eigenschaften haben diese Erkrankungen des Intermediärstoffwechsels gemeinsame klinische Merkmale. Die Patienten werden meistens im frühen Lebensalter durch (Laktat)Azidose, Ketose, Erbrechen, Krampfanfälle und Koma klinisch auffällig.

Im Neugeborenen- und frühen Kleinkindesalter verlaufen diese Erkrankungen häufig letal, die Überlebenden sind mental und statomotorisch schwer beeinträchtigt. Da die Patienten gleichartige klinische Symptome aufweisen, kann eine Erkrankung dieser Stoffwechselwege nur selten klinisch diagnostiziert werden. Die Untersuchung der organischen Säuren ist daher für die Diagnosestellung unabdingbar [4].

Organische Säuren sind Carbonsäuren, die auch andere funktionelle Gruppen beinhalten können; sie sind gut wasserlöslich, reagieren sauer und sind Ninhydrin-negativ. Organische Säuren werden mit Ethylacetat aus dem Urin extrahiert, chemisch verestert (N-Methyl-N-Trimethylsilyltrifluoracetamid (MSTFA)) und letztendlich nach ihrer kapillar-gaschromatographischen Auftrennung mittels Massenspektrometrie (GC-MS) identifiziert [5]. Die Spektren werden mit Hilfe eines computerisierten Suchprogramms mit den authentischen Massenspektren einer Bibliothek verglichen. Die Chromatogramme sind in den meisten Fällen charakteristisch für eine bestimmte metabolische Erkrankung, so dass auf eine Quantifizierung verzichtet werden kann.

Ultralangkettige Fettsäuren (VLCFA)
Die Bestimmung der ultralangkettigen Fettsäuren (VLCFA = very long-chain fatty acids) im Serum gehört zur Basisanalytik bei der Abklärung einer angeborenen peroxisomalen Stoffwechselstörung der Biogenese bzw. eines Enzyms, die oft zu neurologischen Schädigungen führt. Peroxisomen sind Zellorganellen, die sich im Cytoplasma einer Zelle befinden und Enzyme (Oxidasen) für den Abbau von Fettsäuren, Ethanol und anderen Verbindungen enthalten. Des Weiteren katalysieren sie wichtige Schritte der Biosynthese von Lipiden (Plasmalogene) der Myelinscheide von Nerven.
Zu den peroxisomalenen Stoffwechselwegen gehören:

1. α-Oxidation von Phytansäure
2. β-Oxidation von sehr langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren
3. die Biosynthese von Plasmalogenen
4. die Konjugation von Cholsäure im Rahmen der Gallensäuresynthese und
5. die Glyoxylat-Entgiftung [6,7].

Angeborene Enzymdefekte des peroxisomalen Stoffwechsels führen zur Akkumulation der ultralangkettigen Fettsäuren (C22:0 Behensäure; C24:0 Lignocerinsäure; C26:0 Cerotinsäure) sowie der verzweigtkettigen Fettsäuren Pristansäure und Phytansäure. Die Konzentrationen der einzelnen Fettsäuren sowie das Verhältnis C24:0/C22:0 und C26:0/C22:0 werden u.a. zur Diagnostik bzw. Differentialdiagnostik bei Verdacht auf Zellweger-Syndrom, X-linked Adrenoleukodystrophie (ALD), neonatale-Adrenoleukodystrophie (NALD) und M. Refsum herangezogen [6].

Die stark hydrophoben VLCFAs werden nach einer sauren und alkalischen Hydrolyse der Fettsäurenester im Serum freigesetzt. Es folgen die Extraktion der Fettsäuren mit n-Hexan und anschließende Derivatisierung mit N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoracetamid + 1% tert-Butyldimethylchlorosilan (MTBSTFA). Nach der gas-chromatographischen Auftrennung und Identifizierung der einzelnen Fettsäuren mittels Massenspektrometrie werden die VLCFAs anhand von im Analysenansatz mit aufgearbeiteten und analysierten deuterium-markierten Fettsäuren-Standards quantifiziert (Stabilisotopenverdünnungsanalyse) [6].

Twin Line GC-MS
Das Twin Line GC-MS System (Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra) ermöglicht die Analyse unterschiedlicher Substanzen auf zwei verschiedenen Kapillarsäulen mit einem MS-Detektor. Es ist daher nicht notwendig, beim Wechseln zwischen zwei Analysenverfahren, das MS-Gerät zu belüften oder die Säulen auszuwechseln.

Eine Voraussetzung für die Verwendung eines Twin-Line-Systems ist, dass die zwei zu verwendenden Kapillarsäulen ähnliche physikalische Eigenschaften, wie bspw. die gleiche thermische Stabilität, besitzen. Die für die Analyse der organischen Säuren im Urin und der VLCFAs im Serum benötigten Kapillarsäulen erfüllen die o.g. Kriterien, so dass diese zwei Analysenverfahren an einem Twin-Line-Gerät sehr gut durchzuführen sind.

Interpretation: Organische Säuren
Mit Hilfe eines computerisierten Suchprogramms und einer entsprechenden Bibliothek ist die Identifizierung der organischen Säuren relativ einfach. Bisher war dies nur durch die Erstellung eigener Massenspektrumsbibliotheken (Custom-made library) möglich, da es keine kommerziell zu erstehenden Bibliotheken gab. Erschwerend kam hinzu, dass viele wichtige Substanzen nicht käuflich waren [8].

Seit 2007 ist die erste kommerzielle Bibliothek von Shimadzu erhältlich und seit 2013 steht die zweite Version zur Verfügung. Diese beinhaltet die Massenspektren der häufigsten organischen Säuren (als TMS-Ester) sowie von Medikamenten (wie z. B. Valproat-Metabolite). In die Bibliothek können Spektren von neuen Metaboliten direkt aufgenommen und dadurch die diagnostische Kapazität des gesamten Systems verbessert werden.

Mittels Analytik-Software GCMSolution Ver.2.72 (Shimadzu Coorporation) können die Chromatogramme automatisch integriert und das Massenspektrum eines jeden Peaks mit den Spektren in der Bibliothek verglichen werden. Hierbei besteht die Möglichkeit, mehrere Bibliotheken gleichzeitig zu durchsuchen.

Interpretation: VLCFA
VLCFAs sind im Humanplasma in geringen Konzentrationen vorhanden und müssen daher quantifiziert werden. Jede Fettsäure (C22:0, C24:0, C26:0, Pristansäure und Phytansäure) wird einzeln als Massenfragment zusammen mit der jeweils dazugehörigen deuterierten VLCFA dargestellt.

Zusammenfassung
Die Analyse der organischen Säuren im Urin und der VLCFAs im Serum mit einem Twin Line GC-MS-System ist sehr vorteilhaft. Hierbei wird neben den eingesparten Kosten für ein zweites GC-MS-System, die Analysenzeit kürzer, eine bessere Turnaroundtime erreicht und somit ist das Ergebnis schneller für den, den Patienten behandelnden Arzt verfügbar.

Literatur
[1]    Garrod A.: Lancet 2, 1616-1620 (1902)
[2]    Sewell AC.: Medizinische Genetik 13, 353-357 (2001)
[3]    Zschocke J. und Hoffmann GF.: Vadecum Metabolicum, Schattauer  (2012)
[4]    Sass JO. und Sewell AC.: Niessen W Current Practice of Gas Chromatography-Mass Spectrometry, Marcel-Dekker, 341-354 (2001)
[5]    Sewell AC. und Böhles HJ.: Clin Chem, 37, 1301-1302 (1991)
[6]    Wanders RJA. und Duran M.: Blau N, Duran M, Gibson KM Laboratory Guide to the Methods in Biochemical Genetics, Springer, 221-231 (2008)
[7]    Islinger M. et al.: Biochimica et Biophysica Acta 1803, 881-897(2010).
[8]    Sweetmann L.: Hommes FA Techniques in Human Biochemical Genetics, Wiley-Liss, 143-176 (1991)
[9]    De Jesus VR. et al.: Mol Genet Metab 113, 67-75 (2014)

Kontakt
Adrian C. Sewell
Claudia Schroeder

Abteilung für Stoffwechseldiagnostik
Bioscientia Institut für Medizinische Diagnostik
Ingelheim am Rhein
Adrian.Sewell@bioscientia.de
Claudia.Schroeder@bioscientia.de

Kontaktieren

Bioscientia Institut für Medizinische Diagnostik GmbH
Konrad-Adenauer-Straße 17
55218 Ingelheim
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